阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者血漿VIP和β－EP水平的變化及意義

詹俊杰，李 竹，李江華，牟基偉，周旭峰，張美佳，楊琳紅，夏 軍，魏曉麗

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003;2.山東省菏澤市中醫(yī)院，山東菏澤274000)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)可發(fā)病于任何年齡，但以中年肥胖男性為發(fā)病率最高。國外學者的的流行病學調(diào)查顯示，OSAHS的發(fā)病率在一般人群中為2%～4%[1]。關于OSAHS的發(fā)病機制至今仍不十分明確，深入而全面的開展OSAHS的病因?qū)W和病理學等方面的研究，將為臨床的病因診斷和治療OSAHS提供新的理論依據(jù)，具有重要的現(xiàn)實意義和社會價值。

近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn)，血管活性腸肽(VIP)是一種具有很強的擴張血管的作用的神經(jīng)肽類生物活性物質(zhì)，在人體各種組織器官都有著廣泛的分布，而且有文獻報道其與正常睡眠結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)有著密切的關系，但與OSAHS的發(fā)病的相關報道少見。β－EP作為垂體分泌的具有阿片樣生物活性的神經(jīng)肽類物質(zhì)，以神經(jīng)激素的形式參與了眾多復雜的生理功能的調(diào)節(jié)，它的異常分泌與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。它廣泛存在于腦、垂體、胃腸道、血漿和胎盤中，表現(xiàn)出明顯的阿片樣活性，參與多種疾病或者應激反應的病理生理過程，如心血管活動、呼吸運動、體溫調(diào)節(jié)、內(nèi)分泌功能的調(diào)節(jié)等。本實驗從VIP和β－EP在各學科研究的基礎之上從低通氣和睡眠結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)等角度來研究VIP和β－EP在OSAHS病情發(fā)生發(fā)展中的作用，通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測VIP和β－EP在OSAHS患者血漿中的表達情況，并進一步探討二者在OSAHS發(fā)病中的作用及其可能存在的相關性，為OSAHS的臨床預防、病因診斷和治療方面開辟一條新的思路和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 OSAHS組:為2011－01～2011－12在佳木斯大學附屬第一醫(yī)院就診治療的OSAHS患者45例，其中輕中度患者29例(其中男22例，女7例);重度患者16例(其中男13例，女3例)，年齡23～55歲，平均38.7歲。入院前經(jīng)臨床檢查和多導睡眠監(jiān)護儀(PSG)檢查，嚴格按照2002年中華醫(yī)學會呼吸病學分會杭州會議的OSAHS診斷標準。以呼吸暫停低通氣指數(shù)(AHI)為標準對患者進行分度:AHI 5～20次/h為輕度組，AHI 21～40次/h為中度組，AHI＞40/h為重度組，本實驗劃定AHI≤40次/h為輕中度組;AHI＞40/h為重度組。

1.1.2 對照組:15例經(jīng)PSG監(jiān)測排除OSAHS診斷的健康成人在知情同意的合法程序下自愿接受晨起空腹采靜脈血，其中男10例，女5例，年齡21～52歲，平均39.4歲。1.1.3 多導睡眠圖(PSG)檢查

所有研究對象均進行整夜的多導睡眠圖(PSG)監(jiān)測，獲得相關臨床指標。于監(jiān)測前48h內(nèi)不喝酒、咖啡、濃茶、不服用鎮(zhèn)靜藥等，監(jiān)測當天不睡午覺，2周內(nèi)未患上呼吸道疾病。

監(jiān)測項目:心電圖、腦電圖、口鼻氣流、胸腹運動、睡眠體位、鼾聲、血氧飽和度等。檢查指標:AHI、ODT/TST、TST、鼾聲指數(shù)、平均呼吸暫停時間、睡眠時平均血氧飽和度、睡眠時最高血氧飽和度、睡眠時最低血氧飽和度等。

1.2 方法

1.2.1 血漿標本的準備:所有研究對象均空腹，在次晨睡眠監(jiān)測結(jié)束后即抽取外周靜脈血4mL注入含EDTA的試管中保存，立即離心(4℃，2000×g)15min，取上層血漿分2份，1份備測VIP，另1份備測β－EP，均置－70℃冰箱保存待成批測量。標本符合:(1)無溶血;(2)清澈透明;(3)解凍1次;(4)保存時間不超過半年。

1.2.2 ELISA具體操作步驟:(1)實驗準備:實驗開始前，將血漿樣本及試劑盒中的試劑在室溫下完全溶解復溫后在漩渦振蕩器上震蕩充分混勻。注意不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免產(chǎn)生加樣上的誤差。標準品和洗滌液照說明書稀釋。打開酶標儀，預熱，設置檢測程序。(2)加樣:分別設空白對照孔(復孔)、標準品孔(復孔)、樣品孔。加入稀釋好后的標準品50μL于標準品孔內(nèi);在樣品反應孔中加入待測血漿樣品50μL(用樣本稀釋液1:1稀釋)，立即加入50μL的生物素標記的抗體，蓋上封板膜，漩渦振蕩器振蕩混勻，37℃水溫箱溫育1h。(3)洗滌:甩去反應酶標板孔內(nèi)液體，反應酶標板放入已設定參數(shù)的洗板機洗滌，洗滌4次，吸水紙拍干。(4)每孔加入60μL的親和鏈酶素－HRP，旋渦振蕩器混勻，37℃水溫箱溫育30min。(5)洗滌:甩去反應酶標板孔內(nèi)液體，反應酶標板放入已設定參數(shù)的洗板機洗滌，洗滌4次，吸水紙拍干。(6)每孔迅速的按順尋加入底物A和底物B各50μL，使用旋渦振蕩器混勻，37℃水溫箱溫育10min。注意在加入底物A和底物B過程中避免光照。(7)取出反應酶標板，迅速加入50μL的終止液。注意避免光照。(8)在全自動酶標儀450nm波長處測定各孔的吸光度OD值。電腦打印實驗結(jié)果。(9)以標準品吸光度OD值為縱坐標(Y)，以相應的VIP或β－EP標準品的濃度為橫坐標(X)，繪制相應的標準曲線，根據(jù)標準曲線計算出各血漿中VIP和β－EP的濃度。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。組間比較采用單因素方差分析;相關性分析采用 Pearson線性相關分析;P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VIP在OSAHS血漿中的表達

OSAHS組患者血漿中VIP為高表達，三組的VIP表達差異具有顯著性(P＜0.01)。OSAHS輕中度組的VIP濃度顯著高于對照組(P＜0.01);重度OSAHS組的VIP表達明顯高于對照組和輕中度OSAHS組(P＜0.01)。提示血漿中的VIP參與了OSAHS的疾病發(fā)生發(fā)展過程，并且在其中扮演了重要作用見表1。

表1 VIP在OSAHS血漿中的表達(±s)

表1 VIP在OSAHS血漿中的表達(±s)

分組 n VIP(pg/mL)F P對照組15147.60±13.52 522.99 ＜0.01 OSAHS輕中度組 29235.83±16.14*OSAHS重度組 16323.75±14.72*#

2.2 β－EP在OSAHS血漿中的表達

OSAHS組患者血漿中β－EP為高表達，三組的β－EP表達差異具有顯著性(P＜0.01)。OSAHS輕中度組的β－EP顯著高于對照組(P＜0.01);重度OSAHS組的β－EP表達明顯高于輕中度OSAHS組(P＜0.01)。提示血漿中β－EP參與了OSAHS的疾病發(fā)生發(fā)展過程，并且在其中扮演了重要作用，見表2。

表2 β－EP在OSAHS血漿中的表達(±s)

表2 β－EP在OSAHS血漿中的表達(±s)

分組 n β－EP(pg/mL)F P對照組15 82.47±16.47 453.98 ＜0.01 OSAHS輕中度組 29 165.17±16.58*OSAHS重度組 16 253.44±13.51*#

2.3 在OSAHS患者血漿中VIP和β－EP表達的相關性

在OSAHS重度組中，VIP的表達與β－EP的表達呈正相關(r=0.914)，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。表明兩者在OSAHS的發(fā)病過程中具有協(xié)同作用。聯(lián)合檢測二者可能對OSAHS的病因診斷及治療效果的判斷具有重要的理論和臨床價值。

3 討論

OSAHS主要的病理生理改變是呼吸暫停、低通氣和睡眠結(jié)構(gòu)紊亂導致的低氧血癥、高碳酸血癥和微覺醒，引起臨床上出現(xiàn)一系列的癥狀和體征。OSAHS的致病因素較多，但確切的病因及發(fā)病機制尚不清楚，有研究顯示有生物活性因子參與了其中的發(fā)生和發(fā)展[2，3]。

3.1 VIP 與 OSAHS

VIP與睡眠:正常睡眠可分為兩個時相:快波睡眠(REM)和慢波睡眠(NREM)。調(diào)節(jié)睡眠的中樞在于腦干部到前腦基底部的區(qū)域，那里存在著作為神經(jīng)細胞活動基礎的神經(jīng)結(jié)構(gòu)和作為睡眠物質(zhì)基礎的液性機構(gòu)等兩種調(diào)節(jié)機構(gòu)，正常睡眠結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)是在這兩者的共同左右下完成的。Drucker－colin等[4]提出VIP可能是一種參與睡眠結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)的生物活性因子。動物實驗中，往貓、兔等哺乳動物腦室內(nèi)注射一定量的VIP，可以導致其睡眠過程中REM睡眠時相的增加[4，5]，而給予VIP受體抑制劑可導致REM睡眠時相的減少[6]。進一步研究表明VIP能增加REM和NREM睡眠時間，減少NREM－REM循環(huán)次數(shù)，有增加REM/NREM比例的傾向。而OSAHS患者夜間由于反復覺醒可以導致REM睡眠期和NREM深睡眠期明顯減少，睡眠結(jié)構(gòu)紊亂，睡眠有效率下降，病情嚴重患者甚至會有白天嗜睡的現(xiàn)象。以上結(jié)論都提示VIP可能參與了OSAHS患者睡眠結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)。

VIP與缺氧:VIP是一種具有強烈的舒張血管作用的生物活性因子，動物試驗中表明，缺氧缺血性腦損傷大鼠血漿及海馬旁回勻漿中VIP含量增高，壞死神經(jīng)元明顯增加。動物實驗中的家兔缺氧后可導致腦組織及肺內(nèi)的VIP水平增高，引起局部血流增加，耗氧量增加。胎兒窒息時羊水和臍血中的VIP也明顯高于非窒息組。缺氧缺血性腦病患兒血漿的VIP水平明顯升高，可能與缺氧后腦血流的改變及再灌注損傷有關。以上研究提示缺氧可能是VIP釋放的重要誘導因素，而缺氧導致的低氧血癥又是OSAHS最主要的病理基礎。加之OSAHS存在自主神經(jīng)功能紊亂，這與有關學者提出的咽部組織中某些神經(jīng)肽類物質(zhì)尤其是VIP等參與的神經(jīng)源性炎癥是由于血漿中VIP增多引起OSAHS患者咽部血管擴張，血管的通透性增強，組織腫脹加重導致咽腔狹窄，引起咽部反射機制缺陷和局部組織損傷而誘導OSAHS的發(fā)生發(fā)展的觀點是具有一致性的。故可推測OSAHS患者存在高VIP血癥。

本研究VIP的ELISA結(jié)果顯示:OSAHS組患者血漿中VIP為高表達，并且重度OSAHS組的表達明顯高于對照組和輕中度OSAHS組，統(tǒng)計學結(jié)果支持重度OSAHS組與對照組，輕中度OSAHS組與對照組，輕中度OSAHS組與重度OSAHS組三者之間均有顯著性差異(P＜0.01)。提示血漿中VIP參與了OSAHS的疾病發(fā)生發(fā)展過程，并且在其中扮演了重要作用。

在OSAHS患者的睡眠結(jié)構(gòu)紊亂研究方面，鑒于REM期睡眠有極強的生理性節(jié)律[7]，所以有學者認為VIP可能是通過調(diào)節(jié)睡眠中樞的正常生理節(jié)律來調(diào)節(jié)OSAHS患者的REM期睡眠的。也有學者的研究結(jié)果證實了OSAHS患者的晨起血漿中VIP濃度與睡眠效率成正相關，即血中VIP濃度越高，REM期睡眠時間越長，淺睡及醒覺時間越減少，睡眠質(zhì)量與效率就越高，提示VIP參與了OSAHS患者睡眠結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)[8]。OSAHS患者由于上氣道解剖結(jié)構(gòu)異常，軟組織失去了正常的生理功能，導致患者睡眠時產(chǎn)生低通氣從而引起低氧血癥或者高碳酸血癥，造成了機體內(nèi)環(huán)境的紊亂，而VIP作為一種具有舒張血管作用的神經(jīng)肽類物質(zhì)，對咽部軟組織由于缺氧而產(chǎn)生收縮以加強血流的小動脈或者小靜脈具有顯著作用，使其血管擴張和通透性增強，從而緩解局部的缺氧狀態(tài)。但同時由于VIP的擴血管作用，在OSAHS患者的自主神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的大環(huán)境下，其含量的增高引起血管過度擴張，導致血管的超負荷灌注增加，造成局部組織的再灌注損傷和咽部組織的繼發(fā)性腫脹，形成了缺氧→VIP增高→血管擴張，通透性增強→咽部組織腫脹→OSAHS發(fā)生→缺氧的惡性循環(huán)。這與前面提到的神經(jīng)源性學說具有一致性，都為OSAHS患者存在高VIP血癥鑒定了理論基礎。

3.2 β－EP與OSAHS

β－內(nèi)啡肽是一種具有與阿片類生物活性物質(zhì)生物學作用的神經(jīng)肽，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)起著神經(jīng)介質(zhì)和神經(jīng)內(nèi)分泌的作用。由于其有較強的麻醉作用，能產(chǎn)生明顯的心肺功能紊亂，包括心動過緩、低血壓、呼吸抑制和呼吸暫停。有研究認為缺氧可直接作用于呼吸中樞的調(diào)節(jié)吸氣的神經(jīng)細胞，或間接作用于橋腦區(qū)等非呼吸神經(jīng)中樞，引起β－EP的釋放。實驗研究表明，在低氣壓缺氧狀態(tài)下能導致血漿β－EP水平增加，在重度低氧下，β－EP可能參與了成人低氧通氣壓抑的機制，并對外周低氧敏感性有抑制作用。動物實驗中新生鼠缺氧缺血性腦損傷結(jié)果顯示大腦皮層β－EP含量的升高與皮層水腫程度呈正相關。而缺氧缺血性腦病患兒血漿β－EP濃度明顯高于對照組，提示β－EP參與了窒息后腦損傷的病理生理過程。國外有學者報道，嬰兒呼吸暫停綜合征及肥胖通氣過低綜合征小兒腦脊液中β－EP明顯增高，認為β－EP的升高是呼吸暫停的應激反應。許多研究證明，肥胖與β－EP有著密切的關系，肥胖人血清β－EP水平明顯增高，并與體重相關。肥胖小兒血中的β－EP含量是正常對照組的2倍，并且其分泌的節(jié)律性消失，始終維持在恒定的高水平狀態(tài)[9]。其機制可能是低氧血癥和高碳酸血癥導致大腦中的呼吸中樞—延髓的呼吸神經(jīng)元活性增強，而后間接作用與β－EP神經(jīng)元高密度區(qū)，引起β－EP的產(chǎn)生和釋放增加所致[10]。

本研究中β－EP的ELISA結(jié)果顯示:OSAHS組患者血漿中β－EP為高表達，并且重度OSAHS組的表達明顯高于對照組和輕中度OSAHS組，統(tǒng)計學結(jié)果支持重度OSAHS組與對照組，輕中度OSAHS組與對照組，輕中度OSAHS組與重度OSAHS組三者之間均有顯著性差異(P＜0.01)。提示血漿中β－EP參與了OSAHS的疾病發(fā)生發(fā)展過程，隨著AHI指數(shù)的增加，其血漿中的濃度也呈現(xiàn)增高趨勢?？赡苁荗SAHS患者低通氣導致的低氧或高碳酸環(huán)境能夠激活下丘腦→垂體→腎上腺軸，導致垂體前葉促腎上腺皮質(zhì)激素細胞的合成和分泌功能增加，其合成和分泌的產(chǎn)物之一—前阿片素原的含量也相應增加，后者作為β－EP等肽類物質(zhì)的前體，使血漿中的β－EP水平相應升高[11];反過來，血漿中的β－EP的含量增多可反饋性抑制大腦呼吸中樞—延髓的敏感性和主動脈竇、主動脈體化學感覺器對低氧和高碳酸血癥的敏感性[12]，形成缺氧→β－EP升高→呼吸抑制→缺氧的惡性循環(huán)，繼而可使患者表現(xiàn)為混合性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的病理變化。已有研究證實，肥胖患者血漿中的β－EP水平為高表達[13];而肥胖是OSAHS患者的重要的發(fā)病因素之一，本實驗中對是否β－EP水平增高首先導致肥胖從而再導致OSAHS，未給予統(tǒng)計學證實，其機制還有待于進一步研究。

3.3 VIP和β－EP在OSAHS患者血漿中的表達的相關性

在OSAHS重度組中，VIP與β－EP的表達呈正相關，表明兩者在OSAHS的發(fā)病過程中具有協(xié)同作用。聯(lián)合檢測二者可能對OSAHS的病因診斷及治療效果的判斷具有重要的理論和臨床價值。

綜上所述，OSAHS的病因和發(fā)病機制非常復雜，至今仍未得到完全證實。前人在分子生物學水平所做的眾多研究都表明，生物活性因子在OSAHS的發(fā)生發(fā)展過程中都發(fā)揮了極其重要的作用。VIP和β－EP作為其中的兩種神經(jīng)肽類物質(zhì)，即可以作為神經(jīng)介質(zhì)或激素單獨發(fā)揮作用，也有可能共存于同一神經(jīng)元中通過神經(jīng)內(nèi)分泌等各種途徑發(fā)揮作用[14]?？紤]在缺氧環(huán)境中兩者間可能存在協(xié)同作用，其相互的作用關系還有待于進一步深入的研究，其結(jié)果必將有助于進一步闡明OSAHS的病因及發(fā)病機制，為臨床治療特別是重度患者的治療(如采用神經(jīng)肽受體拮抗劑治療)提供新的思路和科學依據(jù)，具有重要的理論和實際價值。

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