齊墩果酸對(duì)白血病HL－60細(xì)胞PI3K、Akt、Cav－1表達(dá)的影響

王迪迪，馬 微，葛堂棟，王明富，張鵬霞

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007;2.牡丹江醫(yī)院，黑龍江牡丹江157011)

白血病的治療一直以化療和骨髓移植為主，雖然近30年來(lái)急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia，AML)的治療的取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但仍然有20%以上的患者難以達(dá)到完全緩解，而且大多數(shù)完全緩解的患者最終還會(huì)復(fù)發(fā)和死亡。因此，更深入的探索AML發(fā)病的分子機(jī)制和治療靶點(diǎn)是當(dāng)前學(xué)者們關(guān)注的焦點(diǎn)?，F(xiàn)階段，抗腫瘤藥物的研發(fā)趨勢(shì)已經(jīng)開(kāi)始從傳統(tǒng)的細(xì)胞毒藥物轉(zhuǎn)向針對(duì)細(xì)胞內(nèi)異常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥物。目前研究表明，在慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、急性髓系白血病(AML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)中均可檢測(cè)到PI3K/Akt信號(hào)通路的異?；罨痆1]。本課題旨在探討

齊墩果酸(oleanic acid，OA)對(duì)白血病HL－60細(xì)胞PI3K、Akt和Cav－1的mRNA表達(dá)以及細(xì)胞形態(tài)的影響，進(jìn)一步明確OA治療白血病的靶點(diǎn)，為抗白血病天然藥物的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

①主要試劑:RPMI－1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物科技有限公司;齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)、RT－PCR試劑盒及DL2000 Marker購(gòu)自TaKaRa公司，MTT試劑盒購(gòu)自Sigma公司，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。引物由TaKaRa公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 各引物序列

②藥品的配制:稱取36.5386mg的OA標(biāo)準(zhǔn)品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)，溶于1.0mL的DMSO中，制成800μmol/L的貯存液備用。

1.2 方法

①細(xì)胞培養(yǎng)及分組:急性早幼粒細(xì)胞白血病系HL－60細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院。用含10%胎牛血清RPMI－1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3天傳代一次。細(xì)胞分為加入DMSO的陰性對(duì)照組和經(jīng)80μmol/L OA處理HL－60細(xì)胞48 h的OA組。

②細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察:經(jīng)4%戊二醛前固定，清洗后用1%餓酸后固定，常規(guī)脫水、浸透、環(huán)氧樹(shù)脂包埋制成樹(shù)脂塊，用LKBV型超薄切片機(jī)切片，鈾鉛雙染，作透射電鏡觀察。

③RT－PCR檢測(cè)PI3K、Akt的mRNA表達(dá):按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

④Westem blot檢測(cè)CAV－1蛋白水平:制備HL－60細(xì)胞蛋白樣品后采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度(按試劑說(shuō)明操作)，檢測(cè)蛋白表達(dá)[1]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用q檢驗(yàn)，指標(biāo)之間的關(guān)系采用相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡觀察

電鏡下活細(xì)胞計(jì)數(shù)，OA組與對(duì)照組活細(xì)胞數(shù)相比明顯減少(比值為0.3754±0.0913，P ＜ 0.01)，平均抑制率為62.46%。電鏡觀察空白對(duì)照組細(xì)胞核完整且核質(zhì)比例增大、核染色質(zhì)分布均勻、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整;OA組呈現(xiàn)細(xì)胞間連接消失、核固縮且異形性明顯、核染色質(zhì)邊集形成新月?tīng)钯N近核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張呈空泡化、線粒體嵴模糊或消失、有凋亡小體形成。見(jiàn)圖1。

圖1 透射電鏡觀察OA作用后HL－60細(xì)胞的形態(tài)(×8000)

2.2 OA對(duì)HL－60細(xì)胞PI3K、Akt、Cav－1 mRNA表達(dá)的影響

2.2.1 OA對(duì)HL－60細(xì)胞PI3K mRNA表達(dá)的影響

OA處理組PI3K mRNA表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度為(0.5805±0.0191)，顯著低于陰性對(duì)照組(0.8615±0.0162)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 OA對(duì)HL－60細(xì)胞PI3K、Akt、Cav－1mRNA表達(dá)的影響(±s)

表1 OA對(duì)HL－60細(xì)胞PI3K、Akt、Cav－1mRNA表達(dá)的影響(±s)

組 別 PI3K/β －actin Akt/β －actin Cav－1/β －actin OA 0.5805±0.0191 0.6789±0.0282 0.7583±0.0112 DMSO 0.8615±0.0162 0.8832±0.0135 0.5701±0.0163

2.2.2 OA對(duì)HL－60細(xì)胞Akt基因表達(dá)的影響

OA處理組Akt mRNA表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度為(0.6789±0.0282)，顯著低于陰性對(duì)照組(0.8832±0.0135)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見(jiàn)表1。

3 討論

白血病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤[2]，其病因和發(fā)病機(jī)制與多種遺傳學(xué)改變密切相關(guān)。細(xì)胞增殖或凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的某一環(huán)節(jié)異常，可使細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)失控和/或?qū)Φ蛲霭l(fā)生抵抗而引起細(xì)胞生長(zhǎng)失控，最終導(dǎo)致腫瘤形成[3]。PI3K/AKT信號(hào)通路激活可抑制多種刺激引發(fā)的細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展、促進(jìn)細(xì)胞生存和增殖、參與血管形成和腫瘤的轉(zhuǎn)移，在惡性腫瘤演變過(guò)程中扮演著重要角色。在細(xì)胞靜息狀態(tài)下，PI3K普遍存在胞漿中，具有酪氨酸蛋白活性的膜受體(如EGFR)和非受體型蛋白激酶(如Src)可激活Ⅰ型PI3K。生長(zhǎng)因子與相應(yīng)的酪氨酸激酶受體結(jié)合后，激活PI3K的催化亞基p110α，后者能催化PIP2肌糖環(huán)上D3位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化為第二信使PIP3。PIP3形成“錨”結(jié)構(gòu)可與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)合，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜。因此，PIP3能與AKT的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，引起胞漿中AKT向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，繼而被細(xì)胞膜上的PI3K依賴性激酶1(PDK1)磷酸化其催化區(qū)的蘇氨酸308位點(diǎn)，而另一個(gè)未知的PI3K依賴激酶2(PDK2)則使絲氨酸473位點(diǎn)磷酸化，這兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)磷酸化是AKT激活的必要條件[4]。AKT是PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一個(gè)重要的下游靶激酶，其下游有眾多的靶分子，激活的AKT從細(xì)胞膜脫離，進(jìn)入細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)，激活或抑制下游靶蛋白，在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平同時(shí)對(duì)其靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而在生理?xiàng)l件下產(chǎn)生抗凋亡、促增殖的活性[5，6]。Xu 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，AML 細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，存在著AKT激酶持續(xù)活化，經(jīng)過(guò)PI3K抑制劑處理后其生存率降低明顯。Kubota等[8]實(shí)驗(yàn)證明，半數(shù)以上AML患者標(biāo)本存在PI3K的持續(xù)性活化。一方面，PI3K/AKT通路中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的活性異?？墒瓜掠蔚蛲鐾肥茏?、加快細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化[9];另一方面 PI3K/AKT通路可能會(huì)因?yàn)槭艿缴嫌胃鞣N受體－配體結(jié)合效應(yīng)的調(diào)控和某些信號(hào)分子活性的影響，異常激活PI3K/AKT通路，而促進(jìn)正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化[10]。研究表明，AKT的活化與白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，80μM OA 作用 HL－60細(xì)胞48h抑制效果最佳[12～14]。此次研究以80μM OA作用HL－60細(xì)胞48h后發(fā)現(xiàn)HL－60細(xì)胞的PI3K、Akt和Cav－1 mRNA表達(dá)降低，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)OA作用后的HL－60細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞抑制率增加，提示OA可能通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)HL－60細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

[1]張偉，楊志明，張鵬霞.齊墩果酸對(duì)人白血病HL－60細(xì)胞端粒酶活性的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2009，32(6):40

[2]李慧，田黎明，徐王月王月，等.MMP －7和 HGF 在白血病中的表達(dá)及其相關(guān)性研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011，34(6):36-37

[3]Kharas MG，Deane JA，Wong S，et al.Phosphoinositide 3 －kinase signaling is essential for ABL oncogenemediated transformation of B－lineage cells[J].Blood，2004，103:4268-4275

[4]Li Y，Qu X，Qu J，et al.Arsenic trioxide induces apoptosis and G2/Mphase arrest by inducing Cbl to inhibitPI3K/Aktsignaling andthereby regulate p53 activation[J].Cancer Letters，2009，11(284):208-215

[5]Wong KK，Engelman JA，Cantley LC.Targeting the PI3K signaling pathway in cancer[J].Current Opinion，2010，2(20):87-90

[6]Martelli AM，Evangelisti C，Chiarini F，et al.The phosphatidylinositol 3－kinase/Akt/mTOR signaling network as a therapeutic target inacute myelogenous leukemia patients[J].Oncotarget，2010，6(1):89-103

[7]Xu Q，Simpson SE，Scialla TJ，et al.Survival of acute myeloid leukemia cells requires PI3 kinase activation[J].Blood，2003，102(3):972-980

[8]Kubota Y，Ohnishi H，Kitanaka A，et al.Constitutive activation of PI3K is involved in the spontaneous proliferation of primary acute myeloid leukemia cells:direct evidence of PI3K activation[J].Leukemia，2004，18(8):1438-1440

[9]劉梅，謝捷明，劉庭波.PI3K/Akt/mTOR通路與急性早幼粒細(xì)胞白血病關(guān)系的研究進(jìn)(Advances on PI3K/Akt/mTOR Signaling Network in Acute Promyelocytic Leukemia)[J].醫(yī)學(xué)綜述，2011，11(7):966-969

[10]Chao X，Zao J，Xiao － Yi G，et al.Blocking of PI3K/AKTinduces apoptosis by its effect on NF－κB activity in gastriccarcinoma cell line SGC7901[J].Biomedicine and Pharmacotherapy，2010，11(64):600-604

[11]丘雅維，楊惠玲.PI3K通路及其抑制劑抗腫瘤的研究進(jìn)展[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2009，30(3S):223-226

[13]張鵬霞，劉淼，陳東，等.齊墩果酸對(duì)HL60細(xì)胞周期調(diào)控因子影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2007，27(9):825-827

[14]楊志明，王迪迪，李麗，等.Bcl－2參與SCID小鼠體內(nèi)齊墩果酸誘導(dǎo)HL－60細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，37(1):11-14