豬細小病毒HA、HI微量法試驗的優(yōu)化

張婉華，鄒 勇，朱永軍，彭麗英，張春玲，蔣鳳英，何錫忠，倪建平

(上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106)

豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病因之一，可引起母豬尤其是初產(chǎn)母豬的繁殖障礙，表現(xiàn)為母豬受胎率降低，產(chǎn)活仔數(shù)減少和(或)出現(xiàn)死胎、木乃伊胎等［1］。PPV具有凝集紅細胞的特性，尤其是對豚鼠和人O型紅細胞。由于人的O型紅細胞來源受限，因此豚鼠紅細胞在實驗室診斷中應用較多。血凝試驗(HA)、血凝抑制試驗(HI)是PPV抗原、抗體檢測的常用方法之一，也是PPV抗原、抗體檢測最為經(jīng)典的方法［2－5］。1986年潘雪珠等建立了試管法，獲得了較為滿意的結(jié)果［6］，但試驗操作及洗滌較為麻煩，且試劑及檢測樣品用量大。本實驗室建立了“U”型微量板HA、HI試驗，但由于紅細胞懸液濃度偏低，判斷結(jié)果往往要等很長時間。本試驗研究了不同紅細胞懸液濃度、不同液體體積、不同形狀微量板對豬細小病毒HA、HI試驗的影響。

1 材料與方法

1．1 微量板 96孔“U”型微量板和96孔“V”型微量板(底角為90°)。

1．2 抗原及抗體 PPV陰性血清、陽性血清、抗原、67份HA檢測樣品，29份HI檢測樣品，本公司研發(fā)中心提供。

1．3 試劑 Alsever液、pH7．4磷酸緩沖液(PBS)、pH7．2磷酸緩沖液(含Ca2+、Mg2+)、25%白陶土懸液，均按常規(guī)方法配制，116℃15min滅菌，4℃保存。

1．4 豚鼠紅血球的配制 采集健康豚鼠血液，按常規(guī)方法配制成不同濃度的紅細胞懸液。

1．5 HA試驗 96孔“U”微量板和“V”微量板，分別采用100μL和50μL液體體積。試驗方法參考文獻［5］，略作改進。豚鼠紅細胞懸液分別采用0．25%、0．5%和 1%的濃度。

67份樣品，通過不同濃度的豚鼠紅細胞懸液，在“U”型和“V”型微量板上進行平行試驗，比較二者差異。以“U”型微量板、0．25%豚鼠紅細胞懸液濃度獲得的結(jié)果為判定標準。

1．6 HI試驗

1．6．1 血清的處理 29份血清56℃水浴滅活30 min。經(jīng)25%白陶土液和25%豚鼠紅血球懸液處理，收集上清液作為原始血清的1∶8稀釋液。

1．6．2 HI試驗 96孔“V”型微量板和“U”型微量板，分別采用25μL和50μL液體體積。試驗方法參考文獻［5］略作改進。豚鼠紅細胞懸液濃度為0．5%。每次測定時設立陽性血清對照、陰性血清對照、抗原對照和紅細胞對照。

29份血清樣品，在“U”型和“V”型微量板上進行平行試驗，比較二者差異。以“U”型微量板、0．25%濃度的豚鼠紅細胞懸液獲得的結(jié)果為判定標準。

2 結(jié)果與分析

2．1 HA試驗 67份樣品在“V”型微量板和“U”型微量板上同時測定HA抗原效價。結(jié)果在“U”型和“V”型微量板上用濃度0．25%和0．5%的豚鼠紅細胞懸液，所獲得的結(jié)果差異不明顯，但在“V”型微量板獲得的結(jié)果更清晰;用1%濃度的紅細胞懸液，結(jié)果與標準結(jié)果差異很大(表1)。

表1 “U”型和“V”型微量板上不同濃度紅細胞懸液不同液體體積的HA試驗結(jié)果

2．2 HI試驗 結(jié)果見表2。29份血清在“V”微量板和“U”微量板上同時測定HI抗體效價，結(jié)果用0．5%濃度的紅細胞懸液與標準結(jié)果差異不明顯，但作用時間明顯縮短，且“V”微量板上獲得的結(jié)果更清晰、更易判斷。

3 結(jié)論

PPV感染診斷方法有多種，但最常規(guī)、最經(jīng)典的HA、HI檢測方法基本可滿足常規(guī)的病原檢測和血清流行病學調(diào)查的需要。本研究通過對不同濃度的豚鼠紅細胞懸液進行比較試驗，發(fā)現(xiàn)提高豚鼠紅細胞懸液的濃度，由原來的0．25%提高到0．5%，用50μL體積進行HA試驗，用25μL體積進行HI試驗，在“V”型微量板上的試驗結(jié)果更清晰、更易判斷。

［1］ 殷 震，劉景華．動物病毒學［M］．第二版．北京:科學出版社，1997．

［2］ 朱潤芝，陳溥言，蘆銀華，等．豬細小病毒病診斷研究進展［J］．中國動物檢疫，2005，22(4):44 －46．

［3］ 蔣玉雯，馮 軍，黃安國，等．豬細小病毒的流行病學調(diào)查［J］．中國獸醫(yī)雜志，1990，(3):7 －9．

［4］ 劉艷華，范偉興，王錫樂．豬細小病毒的研究概況［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2004，31(12):45 －48．

［5］ 中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T1919－2007．豬細小病毒病紅細胞凝集抑制試驗操作規(guī)程［S］．

［6］ 潘雪珠，唐騏駿，葉向陽，等．用血凝抑制試驗檢測豬細小病毒抗體［J］．上海畜牧獸醫(yī)通訊，1985，(4):13 －15．

表2 “U”型和“V”型微量板上0．5%紅細胞懸液不同液體體積的HI試驗結(jié)果