疫苗免疫壓力下新城疫病毒的動態(tài)演化

秦卓明，徐懷英，劉玉山，黃 兵，李玉峰，黃迪海

(1．山東農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所，濟南 250023;2．山東省家禽疫病診斷與免疫重點實驗室，濟南 250023;3．山東省健牧生物藥業(yè)有限公司，濟南 250100)

新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種禽的急性、高度傳染性疾病，是世界公認的兩大最重要的烈性禽類傳染病之一。新城疫自1926年被確診以來，在世界范圍內(nèi)已肆虐86年，在中國的危害也超過70余年，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的災難。由于NDV對養(yǎng)禽業(yè)具有高毀滅性，世界大部分發(fā)達國家普遍采取捕殺辦法撲滅該病。限于國情，我國采取的是強制疫苗免疫預防策略［1］。

30多年來，疫苗免疫對中國新城疫的防控起到了決定性的作用，新城疫的發(fā)病率大大降低。但是，伴隨養(yǎng)禽業(yè)規(guī)模的不斷擴大，養(yǎng)殖密度的不斷提高，雞、鴨、鵝等多種禽類混合飼養(yǎng)，特別是各式各樣弱毒苗和滅活苗的大量使用，使得NDV在強大的疫苗免疫壓力下，出現(xiàn)了不同程度的免疫逃避、基因突變、病毒重組、免疫耐受等現(xiàn)象，甚至在高抗體水平下發(fā)病，這無疑對于傳統(tǒng)的新城疫免疫預防提出了挑戰(zhàn)。

1 高度重視新城疫對中國養(yǎng)禽業(yè)危害的嚴重性

新城疫的免疫預防一直是各級政府和獸醫(yī)主管部門關注的焦點。自2005年以來，我國新城疫發(fā)生的頻率、數(shù)量和規(guī)?？傮w在減少，但每年仍然至少有一半以上的省、市和區(qū)有該病發(fā)生的報道(表1)［2］。眾多的臨床病例表明，新城疫仍然是養(yǎng)雞業(yè)必須關注的重點疫病。

表1 2005年5月-2012年6月新城疫發(fā)病統(tǒng)計表

2 疫苗免疫壓力下的新城疫病毒的遺傳學變異

新城疫疫苗是發(fā)展中國家預防新城疫的重要方法。NDV的免疫導致抗體產(chǎn)生，而抗體反過來又會抑制病毒的繁殖。病毒為了生存，必然要逃避體內(nèi)已有的抗體，否則就會被抗體所消滅。這種通過體液免疫和細胞免疫應答的形式限制、消滅或清除病毒的方式，構(gòu)成了針對病毒本身的特異性免疫壓力，通常稱為免疫選擇壓?，F(xiàn)代的分子遺傳學技術清楚地表明，病毒為了生存，其本能就是利用病毒基因中序列突變的多樣性，產(chǎn)生免疫逃避。

2．1 F基因的遺傳變異 由于疫苗的廣泛應用，目前的NDV流行株基因型已發(fā)生較大改變。流行病學調(diào)查充分顯示，基因Ⅶd亞型在我國當前NDV流行株中占有絕對優(yōu)勢，與經(jīng)典疫苗La Sota株(基因Ⅱ型)核苷酸同源性不足78%。揚州大學在2005－2008年間分離的60株NDV中，有58株屬于Ⅶd亞型［3］。中國動物疫病流行中心2005－2006年間收集的145株NDV毒株，有141株Ⅶd亞型［4］。山東農(nóng)科院家禽所2006－2012上半年期間，山東家禽所分離的38株NDV流行株中，Ⅶd型毒株為35株，占92．1%。此外，我國近期流行的NDVⅦd亞型毒株又分為不同的分支，不同的年代又有一定的差異。

值得關注的是，在我們的周邊國家和地區(qū)，基因Ⅶ型NDV十分普遍，如韓國2000－2006年［5］、日本2001－2007 年［6］、馬來西亞2004 －2005 年［7］均發(fā)生基因Ⅶ型新城疫，且大多數(shù)為Ⅶd型。

2．2 HN基因的遺傳變異 通過對1997－2005年分離的72株中國分離株和國內(nèi)廣東、上海、江蘇、云南等16株NDV野毒的HN基因同源性比較發(fā)現(xiàn)［8］，盡管其地域、宿主和品種(肉種雞、蛋雞、商品肉雞、鵝、鴨、鸚鵡等)不同，但其HN基因全長序列無論是核苷酸還是氨基酸均高度同源:核苷酸同源性為94．4% ～100%，氨基酸同源性為94．6% ～100%，但與疫苗株La Sota、B1和V4等的核甘酸同源性僅為79．8%左右，氨基酸同源性為86．9% ～89%。值得關注的是:與新城疫病毒抗原性密切相關的HN基因氨基酸5個關鍵位點中至少已有3個位點與疫苗株相比發(fā)生了改變。該結(jié)果再次證實，目前的NDV流行株與經(jīng)典La Sota等疫苗株相比，已經(jīng)在臨床上發(fā)生了明顯的變異。

2．3 NDV核心基因變異的生物信息學分析 Miller等［9］利用生物信息學方法，結(jié)合大量的NDV基因組序列，對于影響NDV基因組變異的各種進化因素進行了分析和評估。在NDV編碼的6個基因中，以F融合蛋白的變異頻率最高。所有的氨基酸均處于較強的穩(wěn)定和保守狀態(tài)(亦有人稱為“純化狀態(tài)”)，在免疫選擇壓力下，F(xiàn)融合蛋白顯示出較多的蛋白突變位點。有趣的是，F(xiàn)蛋白裂解位點卻相對保守。在來源于野鳥的毒株中，毒力較強的毒株比弱毒株在F蛋白上顯示出較多的突變位點，由此推測:NDV毒株的進化可以改變病毒的毒力。

Yee等［10］對世界上不同歷史時期、不同國家、不同禽種的54個NDV代表株全長的不同基因，分別進行了生物信息學統(tǒng)計分析。結(jié)果表明:NDV病毒存在不同程度的核苷酸突變，且不同基因之間的分子變異頻率有一定差異，其中以P基因變異的頻率最大，其次是F和HN基因?？偹苤?，在遺傳學中，dN/dS表示的是異義替換(dN)和同義替換(dS)之間的比例。這個比例可以判斷是否有選擇壓力作用于這個蛋白質(zhì)編碼基因。如果dN/dS＞1，則認為有正選擇效應。如果dN/dS=1，則認為存在中性選擇。如果dN/dS＜1，則認為有純化選擇作用［10］。一般認為，同義突變不受自然選擇，而非同義突變則受到自然選擇作用。Yee等［10］通過特異性位點選擇法證實，NDV編碼區(qū)的所有基因，其非同義突變和同義突變(dN/dS)之比均小于1(表2)，表明NDV的進化主要以自我純化為主，變異的頻率相對較小。研究同時表明:在自然狀態(tài)下，P基因和HN基因變異的幾率較大，而疫苗的免疫常常導致M基因和F基因變異較大。盡管如此，幾乎所有的編碼基因均以自我純化為主，突變率通常被局限在一定的范圍內(nèi)，病毒仍具有較高的保守性。

表2 利用特異性位點選擇理論分析疫苗免疫與否對NDV不同編碼區(qū)的影響

2．4 免疫壓力下F和HN基因在實驗室條件下的變異依據(jù) 鞏艷艷等［11］在細胞培養(yǎng)上研究了NDV抗體對其HN基因和F基因變異的影響(表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有抗體組HN基因發(fā)生突變的氨基酸位點數(shù)明顯多于無抗體組，且非同義突變(NS)與同義突變(S)比值NS/S為6，明顯高于無抗體組的NS/S比值3．4。在有抗體組，有5個堿基位點發(fā)生穩(wěn)定的非同義突變，而且其中3個與已知的抗原表位密切相關。F基因在有抗體組也出現(xiàn)了2個穩(wěn)定的突變，無抗體組未發(fā)生變化。但不論在有抗體還是無抗體組，F(xiàn)基因變異的NS/S比均小于2．5。該結(jié)果證實:抗體免疫選擇壓可顯著影響HN基因變異，但對F基因變異的影響小于HN基因。該結(jié)果提示，因使用La Sota疫苗所造成的免疫選擇壓可以導致HN基因抗原性的變異。

表3 新城疫抗體對其自身F和HN基因的影響

3 新城疫病毒自身的基因突變和重組

NDV屬于單股負鏈RNA病毒，具有RNA病毒共有的特征，即缺乏高效的RNA校正酶，加上病毒本身具有較高的復制效率(二十多分鐘一代)，代次間隔時間短，病毒自我糾錯能力有限，使得病毒自身的變異頻率相對于DNA病毒來講相對較高。

3．1 自然狀態(tài)下的NDV變異 NDV抗原性的變化是一個逐步積累的過程，點突變是NDV變異的主要方式，其根本原因是RNA聚合酶缺乏矯正能力。盡管NDV的核苷酸變異頻率(0．98×10－3～1．56 ×10－3/年)遠遠低于流感病毒(3．4 ×10－3/年)，但NDV的變異已成為不爭的事實。NDV基因每年的核苷酸自然突變率一般不高于0．1%，但對于其15．6萬個堿基來講，已是一個不小的數(shù)據(jù)。以澳大利亞為例，因該國相對隔離，該地仍以基因Ⅰ型的弱毒株為主，但目前的毒株與20年前的毒株已有較大差別。

研究同時表明，即便是對于同一基因的不同基因型，其變異的程度亦存在差異，以基因Ⅶ的變異頻率較大，而在所有的基因型中，以基因Ⅱ型相對比較穩(wěn)定。當然，基因Ⅱ型的毒株如La Sota等是目前的主要疫苗候選毒株，這也許是大自然給予養(yǎng)雞業(yè)的一種恩惠。

3．2 不同歷史時期的NDV基因型 病毒本身的變異積累導致了病毒在不同時期的基因型不同。第一次新城疫大流行，發(fā)生在20世紀60年代以前，NDV流行株主要是基因II、III和IV型類型的毒株，危害的對象主要是雞，歷時近30年，經(jīng)亞洲和歐洲傳至世界各地;最近，在非洲的馬達加斯加仍然有IV型的現(xiàn)代版毒株，不過其抗原性和基因型已經(jīng)有了較大的變化，甚至成為一種新的基因型。第二次新城疫大流行，源頭在北美洲，時間在1970－1980年間，基因型為V，病原來源于珍禽，然后危害到雞;第三次新城疫大流行，源頭在中東的鴿子，時間為1980－1990年，基因型為Ⅵ，對雞有一定的致病性。第四次新城疫大流行，源頭比較復雜，與水禽有一定的相關性，基因型主要是Ⅶ，不同的地域、不同的時間，各地流行的Ⅶ型也有差異。南非、中東、歐洲主要流行Ⅶb型，而亞洲東部包括中國內(nèi)地以及于中國的臺灣和香港、南韓、日本等地主要流行Ⅶ型中的a、c、d、e等亞型，且以Ⅶd型為主。

3．3 NDV的重組 有關NDV重組的報道最早始于Chare的研究［12］。他在進行負鏈RNA遺傳進化的研究中發(fā)現(xiàn)，在負鏈RNA病毒的系統(tǒng)進化分析中，從35個負鏈RNA病毒不同基因片段的2154個序列中，至少發(fā)現(xiàn)有5種病毒的79個基因片段可能發(fā)生了重組，其中就包括NDV、Hantaan病毒和麻疹病毒(Mumps Virus)。盡管頻率較低，但仍存在著一定比例的同源重組。耐人尋味的是，首次被證實可能發(fā)生重組病毒的兩株NDV，一株就來自中國的鵝源ND強毒GPMV/QY97－1(簡寫QY97－1)，是最早在國內(nèi)發(fā)生的Ⅶ型NDV的“鼻祖”。另一株則是來自墨西哥的chicken/Mexico/37821/96(簡寫Mexico)。QY97－1是我國最早在南方分離的對鵝有致病性的NDV強毒。通過對其HN基因序列分析，其5端1～273個氨基酸與我國目前廣泛流行的Ⅶ型NDV(代表株ZJ/1/00/Go)同源性在97．7%，而274～570氨基酸則與我國的經(jīng)典強毒F48E9同源性在99．7%，很明顯QY97－1是我國經(jīng)典強毒F48E9和Ⅶ型NDV流行毒在HN基因水平上的病毒重組［13］。而Mexico毒株的重組則發(fā)生在N基因，是 chicken/Mexico/37822/96和 chicken/Italy/Milano/45的重組。更為驚奇的是，這兩個親代毒株竟然來自相差50年并且來源于歐洲和美洲這兩個不同的大陸。人們推測可能是chicken/Italy/Milano/45遠渡重洋，產(chǎn)生后代的結(jié)果。

Miller等［9］利用生物信息學方法，結(jié)合大量的NDV基因組序列分析，對影響NDV基因組變異的各種進化因素進行評估和分析，證實NDV大多數(shù)基因可以發(fā)生重組，并且有一例基因Ⅴ的毒株，其F基因發(fā)生了重組。

QIN等［14］的分離鑒定的名為SRZ03株一株新城疫野毒，重組發(fā)生在F基因，盡管其HN、L、P、M、N基因均屬基因Ⅱ群Ⅶ型NDV，但其F3773－4156片斷很明顯與疫苗相關的基因Ⅱ毒株相關，而其他部分基因均與流行的Ⅶ型NDV有關。

3．4 對重組的質(zhì)疑 一些多年從事NDV研究的學者對于NDV是否發(fā)生重組表示懷疑。Song Qingqing等［15］通過對以前報道的重組株 China/Guangxi09/2003和NDV/03/018進行了跟蹤研究，發(fā)現(xiàn)上述毒株并非是重組株，而是由于NDV分離株不純，導致測序結(jié)果不準確造成的。因此，他們建議對分離株進行克隆測序前必須進行蝕斑純化三代以上。

目前有關NDV的重組尚存在爭論，還缺乏強有力的實驗室證據(jù)。因為，盡管NDV重組的潛在能力存在，但其嚴格的實驗室條件尚需要摸索。

4 免疫壓力下新城疫病毒的抗原性變異證據(jù)

通過病毒中和試驗(VN)、血凝交叉抑制試驗(HI)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和瓊擴試驗(AGP)等大量的研究數(shù)據(jù)表明，NDV不同毒株和分離株之間已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有一定的抗原性差異，盡管這些差異有大有小，甚至相互之間不能產(chǎn)生較好的交叉保護，免疫失敗的現(xiàn)象時有發(fā)生，但大部分的分離株之間均存在一定的交叉反應，其抗原性相關指數(shù)R值均未突破成為不同血清型的閾值［1，16－17］。因此，NDV只有一種血清型，不同毒株間能夠產(chǎn)生不同程度的交叉保護。

4．1 NDV不同毒株間的交叉中和能力 有研究表明:La Sota、Clone30等疫苗對經(jīng)典強毒F48E9之間中和相關指數(shù)(R)較高，為0．77(一般超過0．5就可以達到較好的保護)，顯示出較強的交叉保護能力，但對于目前的NDV流行株中和能力則相對較低，R 普遍低于0．5［16］。其中，僅有15%的 NDV 強毒與疫苗株 La Sota間的同源性在0．5以上，而85%的NDV流行毒與La Sota和F48E9的同源性已降至 0．15 ～0．5［16］。而且，即使同屬于基因Ⅶ型毒株間抗原的同源性變化在0．17 ～0．98 間［15］。

4．2 NDV不同毒株間 HI交叉抑制 研究表明［17］:La Sota與Clone30和經(jīng)典強毒株F48E9的HI抗原同源性最高，分別為0．97和0．98，而與17個流行株的抗原同源性為0．70～0．97，出現(xiàn)了明顯的差異。具體來講，23．5%的NDV流行毒與經(jīng)典強毒株F48E9和疫苗株La Sota間的同源性在0．9以上，但52．9%的NDV流行毒與疫苗株La Sota和經(jīng)典強毒株F48E9的同源性已降至0．70～0．85。

4．3 動物免疫交叉保護能力 Miller等［18］用F基因分屬于不同基因型的五種疫苗:如 B1(ClassⅡ/Ⅱ)、Ulster(ClassⅡ/Ⅰ)、CA02(ClassⅡ/Ⅴ)、Pigeon84(ClassⅡ/Ⅵb)、Alaska196(ClassⅠ)和正常尿囊液對照分別免疫4周齡SPF雞，免疫三周后利用不同的抗原檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同源性抗原免疫抗體較高，反之則相對較低，差異明顯。而ELISA抗體差異不大，顯示出 NDV毒株內(nèi)部的聯(lián)系性(表4)。利用CA02攻毒，結(jié)果表明，除AK196有1只死亡外，其他組均有一定程度的保護，但在攻毒后排毒方面有一定差異，同源的相對排毒率較低，反之，則高。

Cho等［5］以 La Sota疫苗基因組為骨架，將韓國流行的Ⅶd亞型KBNP－4152的F和HN基因替代La Sota基因組的相應部分，并對基因組進行了一系列的基因突變，成功獲得了相應的致弱毒株。以該毒株和La Sota制成滅活疫苗分別免疫115日齡的蛋雞，并在免疫后3周再以另外的一株Ⅶ型SNU5074攻毒，結(jié)果顯示，攻毒后2周和4周，重組疫苗的產(chǎn)蛋率分別為93．2%和94．3%，而La Sota免疫組的產(chǎn)蛋率僅為81．7%和87．3%，比Ⅶd亞型免疫組降低10%左右。

表4 疫苗免疫3周不同抗原檢測的HI抗體平均滴度和ELISA滴度

Min Gu等［19］利用重組的雞痘構(gòu)建了疫苗株La Sota HN基因的 rFPV－La SHN(攜帶 V266，E347和T540位點)病毒和基因Ⅶ流行株Go/JS6/05 HN基因 rFPV－JS6HN(攜帶 A266，K347和 A540位點)病毒，分別免疫SPF雞，三周后利用Go/JS6/05流行毒進行攻毒，結(jié)果證實，rFPV－JS6HN表現(xiàn)出比rFPV－La SHN更好的免疫效果。

以上試驗結(jié)果表明:不論是HI交叉抑制，還是中和反應以及動物交叉免疫試驗，都證實目前中國的NDV流行毒已經(jīng)在抗原性上逐漸偏離經(jīng)典疫苗La Sata株。

5 對新城疫病毒的防控建議

在目前禽病復雜、飼養(yǎng)密度大、家禽和水禽混養(yǎng)等的情況下，生物安全措施作為最基本的措施，顯得更加重要。疫苗免疫只能中和機體體液中的病毒，盡可能減少NDV侵入機體內(nèi)的數(shù)量，降低發(fā)病率，但決不能阻止NDV進入雞群，更不能消滅雞群體內(nèi)特別是細胞內(nèi)已經(jīng)存在的病毒。雞群如果暴露于強病毒包圍的環(huán)境中，即使是免疫雞群，感染率也是極高的。作為群體免疫應答這一生物學系統(tǒng)，即使是頻繁接種各種新城疫疫苗，由于個體免疫的差異，也不可能產(chǎn)生100%的保護。正因為如此，建立健全的生物安全體系至關重要。

鑒于近5年來，引起我國新城疫的流行株主要為Ⅶd亞型，而最常用的新城疫疫苗株主要為基因Ⅱ型的La Sota株，優(yōu)勢流行株與疫苗株的遺傳距離愈來愈遠，即使經(jīng)典疫苗株可誘導產(chǎn)生高滴度的新城疫抗體，但在流行毒強毒攻擊后仍不能得到良好的保護，進而導致免疫的失敗。揚州大學利用反向遺傳操作構(gòu)建的基因Ⅶ型疫苗研究表明［20］，基因Ⅶ型疫苗比傳統(tǒng)疫苗具有以下優(yōu)勢:首先是抗原性和基因型的統(tǒng)一，經(jīng)過改造的Ⅶ型毒株與大多數(shù)流行株一致，均為基因Ⅶd亞型，而在進行致弱和基因修飾后，疫苗備選株NDV/ZJ1HN已成為弱毒，在SPF雞胚盲傳15代無返強，毒力相當穩(wěn)定;二是可有效阻止基因Ⅶ病毒在動物體內(nèi)的復制，不僅能降低攻毒后雞的排毒率，還可有效降低喉氣管和泄殖腔中的排毒率，有效降低病毒排毒10倍以上;三是對鵝、鴨等水禽具有更好的免疫效果;四是比經(jīng)典疫苗La Sota株產(chǎn)生較高的抗體。

新城疫的防控是一個系統(tǒng)工程，消滅該病的任務十分艱巨，必須依靠科學，制定長遠的疫病控制和消除計劃，才能徹底根除新城疫的危害!

［1］ 甘孟候．中國禽病學［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1997．

［2］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局．獸醫(yī)公報2005．1－2012．6［EB/OL］．［2012 －08 －20］．http://www．a(chǎn)gri．gov．cn

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