人臍帶間充質干細胞體外培養(yǎng)、鑒定及其誘導分化的研究

王曉輝，惠 玲，楊霄鵬，王 鯤，楊 雯，哈小琴

人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)是存在于人臍帶華通膠(Wharton＇s jelly，WJ)中的間充質干細胞，其來源于中胚層，形態(tài)和生物學特性與骨髓間充質干細胞相似，可以跨胚層誘導分化為骨、軟骨、骨骼肌、內皮細胞、心肌細胞及神經元等多種組織類型細胞，在組織再生和創(chuàng)傷修復等方面具有重要作用［1-2］。與其他各類干細胞相比，hUCMSCs具有取材方便，無倫理道德及法律限制;細胞數量豐富且單一，污染率低;細胞培養(yǎng)營養(yǎng)要求不高，易于體外擴增分化及細胞工程操作，可作為工程載體用于干細胞治療;白細胞抗原表達低，移植排斥反應小，可用于異體移植;在多種炎性因子誘導下，可以向炎癥部位及缺血缺氧部位遷移，參與血管再生及損傷修復等優(yōu)點，已是目前臨床干細胞移植治療的理想來源［3-4］。

1 材料和方法

1.1 標本來源 經蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院倫理學委員會批準，并且與待產婦及其家屬談話，取得其知情同意后，無菌條件下取正常足月新生兒臍帶15～20 cm，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病病毒(HIV)、EB病毒檢測均為陰性，置于100 ml無菌PBS緩沖液中，送細胞實驗室立即進行hUCMSCs細胞分離培養(yǎng)。

1.2 主要材料及儀器設備 α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、B27、胰蛋白酶等細胞培養(yǎng)試劑購自美國GIBCO公司，培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板購自美國Corning公司，抗體 CD29-FITC、CD35-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD105-FITC、HLA-DR-FITC 購自美國BD公司，抗體兔抗神經巢蛋白(Nestin)多抗、羊抗兔IgG-HRP購自北京中山金橋公司，反式維甲酸(RA)購自美國Sigma公司，堿性成纖維誘導因子(bFGF)購自美國 Invitrogen公司，表皮生長因子(EGF)購自美國Biosource公司。AC2-4S1型生物安全柜為新加坡ESCO公司產品，IX-71型活細胞成像工作站為日本Olympus公司產品，INC153型CO2培養(yǎng)箱為德國美墨爾科技公司產品，流式細胞儀為美國BD公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 hUCMSCs的分離培養(yǎng):采用組織貼壁培養(yǎng)法進行原代間充質干細胞的分離培養(yǎng)。無菌條件下取正常足月新生兒臍帶，0．1 mol/L PBS沖洗后，絲線結扎臍帶兩端，75%乙醇消毒臍帶表面3 min，再次PBS沖洗。去除兩端結扎，PBS反復沖洗臍帶動靜脈中殘留的臍血。將臍帶剪成1 cm小段，剖開臍帶，剔去臍動脈及臍靜脈，剝離出膠原樣的華通膠組織，并且將其剪成約1 mm3的組織塊，加入10 ml的α-MEM完全培養(yǎng)基(10%FBS)接種到培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)第3天，PBS輕柔清洗2遍，去除未貼壁細胞及殘留組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合80%～90%時，按1:3進行傳代，記為P1代細胞。連續(xù)培養(yǎng)傳代P15代細胞，鏡下觀察細胞形態(tài)、密度、生長狀態(tài)等。后續(xù)實驗以P3～P5代、對數生長期的hUCMSCs為實驗對象。

1.3.2 hUCMSCs細胞表型檢測:當hUCMSCs細胞生長融合至80%時，PBS清洗2遍，加入4 ml消化液［0．25% 胰酶，0．01% 乙二胺四乙酸(EDTA)，w/v］，反應30 s后加入等體積的完全培養(yǎng)基終止消化，反復輕柔吹打數次，使細胞完全脫離并吹散，形成單細胞懸液。1000 r/min離心5 min，1 ml PBS重懸細胞沉淀。在每個Ep管中加入100 μl細胞懸液(細胞數量＞106)，分別在每管中加入CD29-FITC、CD35-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD105-FITC 和HLA-DR-FITC 抗體各 5 μl，4℃ 冰箱中避光孵育30 min。流式細胞儀上機檢測各抗原表達量。

1.3.3 hUCMSCs細胞周期檢測:消化、回收hUCMSCs。離心管中加入1 ml的－20℃預冷的70%乙醇，反復輕柔吹打，形成單細胞懸液，4℃固定2 h。PBS洗滌2遍，加入2 ml PI綜合染液(0．005%PI、0．002%RNase A、0．1%枸櫞酸鈉，w/v)，4℃避光孵育30 min。離心棄去PI染液，加入0．5 ml PBS重懸細胞，200目篩網過濾，流式細胞儀上機檢測。

1.3.4 hUCMSCs成神經細胞誘導分化:消化、回收hUCMSCs，加入成神經細胞誘導培養(yǎng)基(α-MEM完全培養(yǎng)基中加入終濃度為0．5 μg/ml RA、20 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF、0．02 g/ml的 B27)重懸細胞，按照5×105個/孔接種到6孔板中，其中放置多聚賴氨酸預處理的無菌蓋玻片，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每4天換液1次，觀察細胞形態(tài)變化。連續(xù)培養(yǎng)14 d后，取出蓋玻片，置于4℃預冷的4%多聚甲醛固定過夜。PBS清洗3遍，5 min/次。置于3%過氧化氫溶液30 min以處理內源性過氧化物酶。PBS清洗3遍，滴加1∶200稀釋的兔抗Nestin多抗，37℃孵育2 h。PBS清洗3遍，滴加1∶200稀釋的羊抗兔IgG-HRP抗體，37℃孵育30 min。PBS清洗后DAB顯色10 min。蘇木素復染，脫水，二甲苯透明，封片后鏡下觀察。

1.3.5 hUCMSCs成脂肪細胞誘導分化:消化、回收hUCMSCs。加入成脂肪細胞誘導培養(yǎng)基［(α-MEM完全培養(yǎng)基中加入終濃度為1 μmol/L地塞米松、0．5 mmol/L 1-甲 基-3-異 丁 基-黃 嘌 呤 (IBMX)、0．1 mmol/L吲哚美辛;10 μmol/L 胰島素)］重懸細胞，按照5×105個/孔接種到6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每4天換液1次，觀察細胞形態(tài)。連續(xù)培養(yǎng)21 d后，PBS清洗2遍，3 min/次，4℃預冷的4%多聚甲醛固定過夜。70%乙醇漂洗，加入油紅O染色5 min，70%乙醇再次漂洗。去離子水漂洗，蘇木素復染后，鏡下觀察。

2 結果

2.1 hUCMSCs原代培養(yǎng)及細胞形態(tài)學觀察 原代培養(yǎng)實驗中，新鮮臍帶經處理后，置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)第2天時，肉眼觀察可見大量成白色小組織塊貼壁，稍微晃動可見培養(yǎng)基黏稠，其間有略透明的糊狀膠質性黏液;鏡下觀察可見部分貼壁細胞，細胞無明顯變形。第3天換液后，鏡下可見貼壁細胞，細胞為梭形或三角形，體積較小，分散于整個培養(yǎng)皿中，可見少量細胞碎片懸浮(圖1A)。繼續(xù)培養(yǎng)，細胞生長速度較緩慢。培養(yǎng)至第7天，可見細胞聚集生長，多個細胞克隆形成，此時細胞生長速度加快(圖1B)。培養(yǎng)至第14天，細胞傳代記為P1代細胞，其生長速度較快，細胞相差明顯，體積變大，呈長梭形和多邊形，平鋪生長(圖1C)。P1代細胞培養(yǎng)至10 d時基本鋪滿整個培養(yǎng)皿，呈漩渦狀，此時細胞為長梭形，細胞鏡下觀察純凈均一，數量豐富(圖1D)。細胞培養(yǎng)傳至第P10代前，細胞生長速度及狀態(tài)與P1代基本一致。隨著繼續(xù)培養(yǎng)梭形細胞逐漸減少，多邊形細胞增多，細胞體積繼續(xù)變大，胰酶消化開始變得困難。第P15代時，細胞還能貼壁，但基本停止生長，胰酶消化約20～30 min，才能使細胞脫落。

圖1 人臍帶間充質干細胞原代細胞培養(yǎng)倒置生物顯微鏡下細胞形態(tài)學觀察

2.2 hUCMSCs細胞表型檢測 hUCMSCs標記單克隆抗體 CD29-FITC、CD35-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD105-FITC和HLA-DR-FITC后用流式細胞儀檢測，用BD CellQuest Pro 6．0軟件分析。發(fā)現hUCMSCs高表達間質細胞標志CD44和CD105，陽性率分別為96．73%和96．10%;整合素受體CD29，陽性率為99．53%。低表達造血系標志 CD34和CD45，陽性率分別為0．80%和1．91%;人白細胞抗原HLA-DR，陽性率為1．41%(圖2)。證實組織貼壁法分離培養(yǎng)獲得的細胞95%以上為hUCMSCs。

2.3 hUCMSCs細胞周期檢測 hUCMSCs經固定后，PI染色，流式細胞儀檢測，ModFit LT 3．2軟件分析，發(fā)現正常 hUCMSCs主要在 G0/G1期，為92．04%;G2/M 期為3．95%;S 期為 4．01%;無凋亡細胞(圖3)。提示分離培養(yǎng)的hUCMSCs細胞狀態(tài)良好，具有較強的增殖潛能。

2.4 hUCMSCs細胞成神經細胞誘導分化 加入成神經細胞誘導培養(yǎng)基第7天后，鏡下觀察:hUCMSCs分散生長，形態(tài)變得不規(guī)則，呈梭形和多邊形，胞質收縮，折光性增強(圖4A)，部分細胞為短梭形，有雙極或多極突起(圖4B);部分細胞突起細而長，具有典型的神經元樣形態(tài)(圖4C);部分細胞呈長條狀，胞質和胞核偏向細胞一側，突起末端分叉(圖4D);少量細胞死亡，脫落呈圓球形的漂浮細胞。突起之間相互連接組成網狀結構。免疫組化檢測成神經細胞誘導14 d的hUCMSCs中神經巢蛋白(Nestin)在胞質中呈陽性表達(圖5)。

圖2 人臍帶間充質干細胞流式細胞儀檢測細胞表型結果

2.5 hUCMSCs細胞成脂肪細胞誘導分化 hUCMSCs加入成脂肪細胞誘導培養(yǎng)基后，細胞生長速度逐漸緩慢。培養(yǎng)到第14天，細胞長度縮短，胞體稍大，胞質中出現明顯小而亮的圓形脂肪小滴，折光性強(圖6A)。培養(yǎng)到第21天時，大量細胞變?yōu)閳A形或橢圓形，胞質中脂滴逐漸增多并相互融合，形成空泡樣、大而透亮的脂肪滴，經油紅O染色可見細胞有大量紅染的脂質沉積，大小不等(圖6B)。

3 討論

干細胞是一類具有自我復制更新、多向分化潛能的原始未分化細胞，是近年醫(yī)學研究的重點及熱點，在細胞替代、組織損傷修復、組織材料工程、臨床干細胞移植等方面有著巨大的應用前景。根據干細胞發(fā)育階段的不同，可分為胚胎干細胞(ESC)和成體干細胞［5］。

間充質干細胞(MSC)屬于成體干細胞，最早在骨髓中發(fā)現，其來源于發(fā)育早期的中胚層，近年來的研究發(fā)現MSC有多種組織來源，包括脂肪、滑膜、胰腺、外周血、羊水、臍血、胎盤等［6］。MSC具有多向分化潛能，早期研究認為其可以向由中胚層發(fā)育的組織細胞分化，如脂肪、骨、軟骨、肌腱、內皮等細胞，隨后研究發(fā)現MSC還可向內胚層肝卵圓細胞和外胚層神經元細胞分化［7］。雖然目前基礎研究最早最多的MSC是骨髓間充質干細胞(BMSC)，但是應用于臨床還受到自身不足的限制，如在骨髓中數量極少，僅為0．001%～0．01%［8］;隨著供者年齡增大或體外的長期培養(yǎng)，細胞增殖和分化能力大幅度衰退［9］;取材過程會對供者造成損傷，而且取材量亦有限，很難滿足臨床應用數量的需求［10］;易受到病毒等病原微生物污染，臨床應用不容易質控［11］;存在移植免疫排斥反應等。

圖3 人臍帶間充質干細胞流式細胞儀檢測細胞周期結果

圖4 人臍帶間充質干細胞成神經細胞誘導7 d細胞形態(tài)學改變

圖5 人臍帶間充質干細胞成神經細胞誘導神經巢蛋白免疫組化結果(DAB×40)

圖6 人臍帶間充質干細胞成脂肪細胞誘導結果

hUCMSCs是來源于臍帶WJ中的一類MSC。與其他類型的MSC相比，hUCMSCs有以下優(yōu)勢:①發(fā)育階段相對更為原始，具有更加廣泛的分化潛能;②來源于分娩后的廢棄物組織，取材經濟方便，不會對供者造成損害;③因為來源于廢棄組織，無法律、倫理限制;④在WJ中細胞數量豐富且細胞純凈單一，可以滿足臨床細胞移植、基因治療及組織工程的要求［12］;⑤細胞營養(yǎng)需求相對較低，具有較強體外增殖能力和傳代穩(wěn)定性;⑥細胞污染率較低;⑦外源基因易轉染，可作為載體工程細胞用于治療;⑧免疫原性低，移植排斥反應小，可用于異體移植;受多種炎性因子誘導，定向炎癥部位及缺血缺氧部位遷移歸巢等［13-15］。因此 hUCMSCs是理想的干細胞來源，在細胞移植治療、基因靶向治療、組織材料工程等方面具有廣泛的應用前景，是近年干細胞研究的熱點之一。目前國內外多家干細胞治療中心都開展了hUCMSCs臨床移植治療的應用［16-17］。

目前hUCMSCs分離培養(yǎng)方法主要分為3類:流式細胞儀分選法、胰酶或膠原酶消化法、組織塊貼壁培養(yǎng)法。流式細胞儀分選法對儀器設備條件要求高，操作步驟復雜，實驗成本高，其應用受到了實驗條件的限制。胰酶或膠原酶消化法，雖然獲得的細胞數量較多，但是消化時間不易控制，易對細胞造成損傷，影響后期細胞實驗，而且WJ含有大量的膠原和透明質酸，消化后形成的黏液嚴重影響了原代細胞貼壁。組織塊貼壁培養(yǎng)法利用了間充質干細胞對培養(yǎng)皿較強貼壁生長能力的特性，雖然細胞分離純化時間稍長，但具有成本低廉，操作簡便，對細胞損傷小，細胞易貼壁，不影響后期實驗等優(yōu)點［18］，因此本研究中采用了組織塊貼壁培養(yǎng)法。

本研究利用組織塊貼壁培養(yǎng)法成功從臍帶中獲取了hUCMSCs原代細胞。培養(yǎng)第3天時，鏡下觀察到貼壁細胞為梭形或三角形，體積較小，分散于整個培養(yǎng)皿中，可見少量細胞碎片懸浮，隨后可見多個細胞克隆形成。原代細胞傳代后，細胞生長速度加快，細胞為長梭形和多邊形，平鋪生長。當長滿整個培養(yǎng)皿時，細胞為長梭形，整體為漩渦狀，鏡下觀察細胞純凈均一，數量極其豐富。有研究表明hUCMSCs在體外培養(yǎng)擴增到80代，通過測定α-平滑肌肌動蛋白而證實其前后表達無明顯變化［19］。而本研究發(fā)現，hUCMSCs體外擴增培養(yǎng)第10代前，細胞生長速度、細胞狀態(tài)基本一致，繼續(xù)培養(yǎng)，長梭形細胞逐漸減少，多邊形細胞增多，細胞體積變大，胰酶消化開始變得困難。到第15代時，細胞還能正常貼壁，但基本停止生長，胰酶消化需20～30 min，才能使細胞脫落。文獻報道，這可能與CD29和CD105表達下降，引起hUCMSCs分化及對生長因子反應能力降低有關［20-21］。

在細胞表型方面，目前研究認為hUCMSCs高表達間質細胞標志CD44、CD90、CD105;整合素受體CD29、CD49b、CD49c、CD51，不表達造血系標志CD34、CD45;協同刺激分子 CD80、CD86、CD40;人白細胞抗原 HLA-DR、HLA-G、HLA-DP、HLA-DQ;內皮標志 CD31 或 CD33、CD14、CD56 等［21-22］。本研究通過對獲得的hUCMSCs細胞表型進行鑒定，發(fā)現hUCMSCs高表達間質細胞標志CD44和CD105，陽性率分別為96．73%和96．10%;整合素受體CD29，陽性率為99．53%。低表達造血系標志 CD34和CD45，陽性率分別為0．80%和1．91%;人白細胞抗原HLA-DR，陽性率為1．41%。證實了經組織貼壁法分離、培養(yǎng)獲得的細胞95%以上為hUCMSCs。同時對hUCMSCs細胞周期進行了檢測，92．04%的細胞處于G0/G1期;3．95%處于G2/M期;4．01%處于S期;無凋亡細胞。證明了細胞狀態(tài)良好，增殖潛能活躍。

hUCMSCs具有多向分化潛能，可以跨胚層誘導分化為骨、軟骨、真皮組織、骨骼肌、心肌細胞及神經元等多種組織類型的細胞［13-14，23］。本研究誘導hUCMSCs向成神經細胞方向分化，發(fā)現細胞出現典型的神經元樣形態(tài)改變，同時細胞Nestin蛋白呈陽性表達;誘導向成脂肪細胞分化發(fā)現，細胞胞質中出現明顯小而亮的圓形脂肪小滴，并且逐漸增多，相互融合，形成空泡樣、大而透亮的脂肪滴，經油紅O染色可見大量紅染的脂質沉積，大小不等。

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