血塞通對(duì)局灶性腦梗死大鼠海馬Nogo-A表達(dá)的影響*

吳建華 張曉倩 朱陵群

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100070）

成人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生能力微乎其微，主要的影響因素之一就是中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境中存在著眾多的抑制性因子。在已知的諸多抑制因素中Nogo-A是最主要的中樞神經(jīng)軸突生長(zhǎng)抑制因子［1］。中藥血塞通在缺血性腦血管病的治療中具有很好的療效，本研究通過(guò)觀察大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型不同恢復(fù)時(shí)間點(diǎn)大腦海馬區(qū)病理學(xué)改變以及Nogo-A蛋白含量的變化，探討藥物血塞通對(duì)腦缺血后中樞神經(jīng)的保護(hù)、功能重建的作用機(jī)理以及血塞通不同劑量應(yīng)用所產(chǎn)生的不同療效。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（300±20）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK（京）2006-0009。

1.2 藥物與試劑 尼莫地平片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字 H20003010），規(guī)格：每片 30 mg；注射用血塞通凍干粉（昆明制藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026438），主要成分為三七總皂苷，規(guī)格：每瓶400 mg。2636型尼龍栓線：線身直徑0.25 mm，線頭直徑（0.34±0.02）mm，線長(zhǎng) 40 mm，購(gòu)自北京沙東生物技術(shù)有限公司。Nogo-A為兔多克隆抗體（美國(guó)santa cruz公司，批號(hào)：sc-25660），SP 試劑盒、DAB 顯色試劑盒均購(gòu)自北京百事創(chuàng)新科技有限公司。

1.3 MCAO模型制備 大鼠編號(hào)稱體質(zhì)量后隨機(jī)分為手術(shù)組和非手術(shù)組（正常組）。手術(shù)組動(dòng)物參考文獻(xiàn)采用改良的EZ Longa方法［1］制備大鼠MCAO模型。術(shù)前12 h禁食不禁水，腹腔注射3.5％水合氯醛麻醉（10 mL/kg），仰臥位固定，于頸正中縱行切開皮膚，鈍性分離頸部肌群，游離頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）與頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），結(jié)扎ECA近分叉處和CCA近心端，用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉CCA遠(yuǎn)端，在CCA結(jié)扎與夾閉兩處之間用虹膜剪剪開一小口，將浸于肝素生理鹽水中的尼龍線栓沿CCA插入ICA，并順I(yè)CA推進(jìn)18~22 mm，稍遇阻力停止，即可造成大腦中動(dòng)脈的阻斷，然后結(jié)扎頸總動(dòng)脈固定栓線，縫合皮膚，放到籠中并保暖。MCAO模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)采用Longa EZ評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［1］：0 分，無(wú)神經(jīng)缺損表現(xiàn)；1 分，對(duì)側(cè)前爪不能充分伸展；2分，向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分，不能行走，意識(shí)喪失。動(dòng)物清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，1至3分者為納入標(biāo)準(zhǔn)，0分和4分者剔除。

1.4 分組及給藥 所有納入實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物，根據(jù)Longa評(píng)分和體質(zhì)量隨機(jī)分組，分為模型組，血塞通大劑量組，血塞通小劑量組和尼莫地平組以及未手術(shù)的正常組5組。給藥劑量按大鼠與人的體表面積等效劑量折算，尼莫地平片每日為1.44 mg/100 g；血塞通小劑量每日為3.6 mg/100 g；血塞通大劑量每日為7.2 mg/100 g。各組大鼠均于當(dāng)日手術(shù)后5 h給藥，血塞通大、小劑量組進(jìn)行腹腔注射，尼莫地平組予以尼莫地平混懸液灌胃，模型組和正常組每日腹腔注射等體積生理鹽水，藥物每日新鮮配制，各組大鼠每3日稱1次體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量重新計(jì)算每只動(dòng)物的給藥量，直到取材當(dāng)日處死時(shí)。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 于術(shù)后第7、14、28日3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行取材。（1）蘇木素-伊紅（HE）染色。在各時(shí)間點(diǎn)，每組大鼠用腹腔注射3.5％水合氯醛麻醉后，使用PBS和4％多聚甲醛心臟灌注，然后將大鼠快速斷頭處死，冰上取腦，4％多聚甲醛浸泡固定，視交叉后2 mm取腦組織，常規(guī)脫水浸蠟包埋，行5 μm厚度切片。每只大鼠取1張含有海馬區(qū)的切片，切片脫蠟至水，進(jìn)行常規(guī)HE染色。（2）免疫組化染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸緩沖液修復(fù)、3％過(guò)氧化氫避光浸泡。4℃孵育滴加兔抗Nogo A多克隆抗體（1∶25）至少16 h。生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min，使用PBS緩沖液清洗數(shù)次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液后，孵育時(shí)間與溫度與二抗相同。然后在室溫下滴加DAB顯色劑避光顯色，顯色完畢后自來(lái)水終止顯色。常規(guī)脫水中性樹脂透明封片。以0.01 mol/L PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。（3）圖像與數(shù)據(jù)分析。使用OLYMPUS BX60型顯微鏡和SPOT-Ⅱ軟件進(jìn)行圖像采集，用Meta Morph Universal imaging corporation軟件進(jìn)行圖像分析。各組各時(shí)間點(diǎn)的免疫組織化學(xué)圖像分析采用陽(yáng)性信號(hào)光密度值作為參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)后進(jìn)行方差分析，應(yīng)用SPSS10統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以（±s）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 見表1。模型組術(shù)后5 h神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重，評(píng)分較高，術(shù)后48 h缺損的神經(jīng)功能有所恢復(fù)，評(píng)分開始下降，術(shù)后72 h評(píng)分，模型組顯著高于尼莫地平組和血塞通各組（P＜0.05 或 0.01）。

2.2 一般狀態(tài) 正常組SD大鼠活動(dòng)靈活，精神狀態(tài)良好。術(shù)后24 h內(nèi)各組大鼠活動(dòng)度較差，皮毛不光澤，反應(yīng)遲鈍，蜷縮聚集，飲食飲水受限，24 h后，手術(shù)各組大鼠開始飲食飲水，但精神、反應(yīng)和活動(dòng)度仍然較差。術(shù)后7 d各組大鼠精神、反應(yīng)及活動(dòng)度有好轉(zhuǎn)，血塞通組和尼莫地平組較模型組好轉(zhuǎn)明顯，能自由活動(dòng)。術(shù)后14 d各組大鼠恢復(fù)很快，飲食飲水正常，活動(dòng)度較好。術(shù)后28 d，各組動(dòng)物一般狀態(tài)接近正常，活動(dòng)度跟正常動(dòng)物無(wú)明顯的差異。正常組的動(dòng)物精神狀態(tài)，活動(dòng)度，飲食飲水一直很好。

2.3 形態(tài)學(xué)觀察 HE染色正常組大鼠海馬區(qū)內(nèi)的神經(jīng)元數(shù)量較多，且排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞體積大，核大而圓，核仁明顯；而模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，界限不清楚，神經(jīng)元之間間隙增大，正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，較多神經(jīng)元呈固縮狀壞死。與模型組相比，血塞通大小劑量組和尼莫地平組病理形態(tài)變化得到一定程度的改善，海馬神經(jīng)元排列較整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，固縮的神經(jīng)元數(shù)量較少，且血塞通大劑量組較小劑量組的病理形態(tài)變化改善明顯。

2.4 MCAO術(shù)后大鼠海馬Nogo-A蛋白表達(dá)的變化見表2。模型組在MCAO 術(shù)后7、14、28 d的海馬Nogo-A的表達(dá)持續(xù)增高，均顯著高于正常組，具有非常明顯差異（P＜0.01）。各藥物組Nogo-A的表達(dá)均低于模型組，其中血塞通大劑量組、尼莫地平組在給藥后7、14、28 d的海馬Nogo-A 的表達(dá)均顯著低于模型組，具有明顯差異（P＜0.01）；血塞通小劑量組海馬的No-go-A的表達(dá)在給藥后28 d顯著低于模型組，具有顯著差異（P＜0.05）；血塞通大劑量組的Nogo-A的表達(dá)在28 d明顯低于血塞通小劑量組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（分，±s）

與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組 別 n尼莫地平組 21正常組 7模型組 18術(shù)后5 h 術(shù)后24 h 術(shù)后48 h 術(shù)后72 h 2.05±0.6 1.76±0.44 1.67±0.48 1.28±0.46**0 0 0 0 2.00±0.59 1.89±0.58 1.83±0.51 1.78±0.43血塞通大劑量組 18 2.11±0.47 1.78±0.55 1.67±0.59 1.38±0.50**血塞通小劑量組 18 2.06±0.54 1.83±0.38 1.77±0.42 1.33±0.48*

表2 各組大鼠海馬Nogo-A蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠海馬Nogo-A蛋白表達(dá)水平比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較，△△P＜0.01。

組 別 n尼莫地平組 8正常組 8模型組 8 7 d 14 d 28 d 0.149±0.019** 0.167±0.014**△△ 0.196±0.016**△△0.147±0.013**0.153±0.016** 0.156±0.019**0.179±0.015△△ 0.201±0.020△△ 0.239±0.018△△血塞通大劑量組 8 0.152±0.013** 0.179±0.013**△△ 0.204±0.015**△△血塞通小劑量組 8 0.161±0.014 0.187±0.012△△ 0.215±0.017*△△

3 討論

缺血性腦血管病后，中樞神經(jīng)功能的重建一直是影響腦科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展的最重要的問(wèn)題之一。原因在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的環(huán)境中既存在著營(yíng)養(yǎng)因子，又存在著阻止神經(jīng)的抑制因子。近年來(lái)研究已經(jīng)證實(shí)在中樞神經(jīng)功能的重建過(guò)程中存在著多種神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子，其中Nogo-A具有很強(qiáng)的軸突生長(zhǎng)抑制作用，被認(rèn)為是阻止中樞神經(jīng)再生的關(guān)鍵因素［2-3］。Nogo-A由少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的整合膜蛋白，在成年哺乳動(dòng)物中主要存在與中樞神經(jīng)系統(tǒng)［4］。早在80年代，已經(jīng)有學(xué)者開始陸續(xù)發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)的相關(guān)蛋白，但直到2000年，由Chen、Prlnjh 等人了首先克隆出了 Nogo 基因［5］。該基因的發(fā)現(xiàn)對(duì)于缺血性腦血管病的治療具有重要意義。在近年來(lái)的缺血性腦疾病的研究中，如何通過(guò)藥物、基因以及生物學(xué)手段，解除該基因的抑制作用，成為缺血性腦疾病后促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和重塑神經(jīng)功能的熱點(diǎn)方向。

本實(shí)驗(yàn)的線栓法大鼠中動(dòng)脈阻塞（MCAO）模型目前應(yīng)用最廣泛，多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)其進(jìn)行了很多研究、改進(jìn)，使其成為一種比較穩(wěn)定、可靠、能反映人類腦缺血疾病的動(dòng)物模型。該模型相比開顱操作等其他方法具有創(chuàng)傷小，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，但是模型的最關(guān)鍵步驟是在非直視情況下完成的，因?yàn)閷?duì)于實(shí)驗(yàn)材料的選擇具有較高的要求。其中最關(guān)鍵的因素為動(dòng)物的體重選擇與線栓的插入尺寸。目前報(bào)道300g左右的大鼠應(yīng)使用直徑0.25 mm的插線，自頸總動(dòng)脈分叉處插入18±5 mm［6-7］。

血塞通主要成分為三七總皂苷，中藥三七活血化瘀、化瘀而不傷正氣。血塞通對(duì)脊髓損傷、腦出血、腦缺血后受損神經(jīng)元有保護(hù)作用，已經(jīng)在臨床廣泛應(yīng)用［7-8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血塞通組在術(shù)后的精神狀態(tài)、活動(dòng)度均較同時(shí)間點(diǎn)模型組有所改善，在從恢復(fù)時(shí)間上更快，而且術(shù)后腦部梗死范圍較小，組織結(jié)構(gòu)更完整，提示了血塞通對(duì)于大鼠腦缺血后對(duì)腦組織具有更好的保護(hù)作用；模型組7、14、28 d的海馬Nogo-A的表達(dá)持續(xù)增高，均顯著高于正常組，而各藥物組Nogo-A的表達(dá)均低于模型組，其中血塞通大劑量組、尼莫地平組在給藥后7、14、28 d的海馬Nogo-A的表達(dá)均顯著低于模型組具有非常顯著性差異，提示Nogo-A可能在腦缺血早期即發(fā)揮其抑制軸突再生的作用，而其長(zhǎng)時(shí)間的高水平表達(dá)可能是腦損傷后神經(jīng)元再生困難的原因之一，而血塞通可以下調(diào)Nogo-A的表達(dá)，這可能是血塞通能夠促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)的原因之一。而且血塞通大劑量組在降低Nogo-A基因表達(dá)方面具有更明顯的作用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，血塞通在術(shù)后促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、組織結(jié)構(gòu)重建以及腦功能恢復(fù)方面具有較好的效果，為今后的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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