療效評價中酶聯(lián)免疫吸附試驗數(shù)據(jù)處理的方法學(xué)研究*

金樹根 孫學(xué)華 雷 燕 李 曼 高月求，3△

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院細胞免疫實驗室 (上海，201203) 2.上海市中醫(yī)臨床重點實驗室 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病科

一直以來，國內(nèi)在藥物體外抗病毒療效評價中，因價格相對便宜，病毒抗原蛋白含量檢測很多是采用ELISA檢測，雖不少研究采用人工合成的病毒抗原蛋白作為標準品做梯度稀釋并曲線擬合進行病毒抗原蛋白定量［1，2］，更多實驗中病毒抗原蛋白定量是簡單直接采用OD值表示，認為藥物對病毒抑制率 (%)=(空白對照組平均OD值－藥物干預(yù)組平均OD值)/空白對照組平均 OD值 ×100%，半數(shù)抑制濃度(50%concentration of inhibition，IC50，又稱半數(shù)有效濃度EC50)即為空白對照組平均OD值一半時的藥物濃度［3～5］。然而，在我們實驗時發(fā)現(xiàn)，與基于CL、TRIF檢測技術(shù)可出陽性結(jié)果并求出IC50不同，基于ELISA檢測技術(shù)的科華ELISA試劑檢測HBsAg和HBeAg時，同一藥物同一濃度采用目前計算方法卻沒有陽性結(jié)果，無法求出 IC50。鑒此，我們對基于ELISA檢測技術(shù)所得數(shù)據(jù)進行IC50計算的方法學(xué)進行研究，以便為病毒療效評價提供準確信息。

1 材料與方法

1.1 一般材料 ①儀器:全波長酶標儀 (SpectraMax M5e，Molecular Devices;Powerwave XS Universal MQX200R，Biotek)，濾光片檢測技術(shù)的酶標儀 (Multiskan Ex，F(xiàn)ortune-labsystems;KHB ST-360，上?？迫A公司，簡稱科華)，全自動化學(xué)發(fā)光儀(I2000，美國ABBOTT公司，簡稱ABBOTT)、時間分辨熒光分析儀 (Efficuta型，新波生物技術(shù)有限公司，簡稱新波生物)。②試劑:HBsAg和HBeAg ELISA試劑盒 (科華)，HB-sAg和HBeAg CL診斷試劑盒 (ABBOTT)，HBsAg和HBeAg TRIF分析試劑盒 (新波生物)。③樣品:HepG2和HepG2.2.15細胞株培養(yǎng)上清液 (本院細胞免疫實驗室提供)。

1.2 樣本預(yù)處理 將收集保存好的HepG2和HepG2.2.15細胞株培養(yǎng)上清液解凍，用HepG2細胞株培養(yǎng)上清液對HepG2.2.15細胞株培養(yǎng)上清液進行2、4、8、16、32、64、128倍稀釋，以備檢測用。

1.3 樣品檢測 ①ELISA:將HepG2.2.15細胞株培養(yǎng)上清液原液和2、4、8、16、32、64、128倍稀釋液作為標準液，以HepG2細胞株培養(yǎng)上清液為陰性實驗對照，按說明書進行操作，采用450/630nm雙波長進行檢測，OD=OD450－OD630。②CL分析:按說明書，由曙光醫(yī)院檢測中心完成。③TRIF分析:按說明書，由曙光醫(yī)院檢測中心完成。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用CurveExpert軟件分析對ELISA檢測數(shù)據(jù)進行曲線擬合并計算待測樣品的相對濃度。

2 結(jié)果

2.1 HepG2.2.15細胞株培養(yǎng)上清液不同稀釋倍數(shù)HBeAg ELISA檢測OD值變化 見表1。發(fā)現(xiàn)原倍對半稀釋 (真正IC50濃度)時OD值與原倍血清OD值不是對半的關(guān)系，有時相當(dāng)接近。

表1 HepG2.2.15細胞株培養(yǎng)上清液不同稀釋倍數(shù)HBeAg ELISA檢測OD值變化

2.2 HepG2.2.15細胞株培養(yǎng)上清液HBeAg ELISA檢測OD值與樣品濃度關(guān)系 見圖1。

圖1 HepG2.2.15細胞株培養(yǎng)上清液不同稀釋倍數(shù)HBeAg ELISA檢測OD值變化曲線

由圖1可見HBeAg濃度 (y軸)與OD值 (x軸)非直線相關(guān)，呈類似拋物線型曲線關(guān)系。采用相關(guān)系數(shù) (r)最接近1的標準曲線擬合進行未知樣品檢測結(jié)果換算。

2.3 不同批次試劑、不同批次實驗的HBeAg ELISA檢測OD值變化 結(jié)果見表2、圖2(A、B)以及表3、圖3(A、B)。其結(jié)果顯示，不同批次試劑、不同批次實驗的HBeAg ELISA檢測OD值均各不相同，其OD值與樣品濃度關(guān)系呈類似拋物線型或S型等曲線關(guān)系。

表2 不同批次試劑HBeAg ELISA檢測OD值變化

圖2 不同批次試劑HBeAg ELISA檢測OD值變化曲線(其中A為2011年批次試劑，B為2008年批次試劑)

圖3 同批次試劑不同批次實驗HBeAg ELISA檢測OD值變化曲線(其中A為20110325批次實驗，B為20110331批次實驗)

表3 同批次試劑不同批次實驗HBeAg ELISA檢測OD值變化

2.4 不同酶標儀對HBsAg ELISA檢測OD值變化的影響 見表4、圖4(A～C)。因原實驗室SpectraMax M5e酶標儀儀器故障，我們改用另外一臺Fortune-labsystems酶標儀進行檢測，發(fā)現(xiàn)新鮮與冷藏樣品倍半稀釋，發(fā)現(xiàn)最高濃度樣品OD值偏低近1，而且樣品濃度與OD值呈S線型關(guān)系。我們進而采用單位內(nèi)3臺不同酶標儀進行比較研究，發(fā)現(xiàn)只有采用 Biotek酶標儀檢測結(jié)果與SpectraMax M5e酶標儀檢測結(jié)果相當(dāng)，而Fortune-labsystem酶標儀與科華酶標儀結(jié)果類似，高濃度樣品OD值偏低近1，而且樣品濃度與OD值呈S線型關(guān)系。

表4 不同酶標儀對HBsAg ELISA檢測OD值變化的影響

圖4 不同酶標儀對HBsAg ELISA檢測OD值變化曲線(其中A為Fortune-labsystems酶標儀，B為Biotek酶標儀，C為科華酶標儀)

2.5 檢測樣品保存條件對HBeAg ELISA檢測的影響 見表5。

表5 檢測樣品不同保存條件對HBeAg ELISA檢測OD值變化的影響

與新鮮樣品相比較，檢測樣品冷藏對ELISA檢測結(jié)果影響不大，樣品濃度與OD值仍呈類似拋物線型關(guān)系，但檢測樣品冰凍后復(fù)融對ELISA檢測結(jié)果影響大，表現(xiàn)在實驗中有時為1/2稀釋樣品的OD值反而比原倍樣品的OD值還高，樣品濃度與OD值仍呈類似S線型關(guān)系，特別是人的混合血清生理鹽水稀釋后檢測此現(xiàn)象多見 (數(shù)據(jù)從略)。

2.6 3種檢測方法檢測HBsAg和HBeAg含量的比較 見表6。CL、TRIF檢測結(jié)果有良好線性關(guān)系，但ELISA檢測進行曲線擬合后，結(jié)果與CL、TRIF檢測結(jié)果相一致。

2.7 不同稀釋液對HBsAg和HBeAg ELISA檢測的影響 見表7。雖然不同稀釋液對HBsAg和HBeAg ELISA檢測OD值有影響，但進行曲線擬合后，其結(jié)果是相一致的。

表6 HepG2.2.15細胞株培養(yǎng)上清液不同稀釋倍數(shù)HBsAg和HBeAg ELISA檢測與CL、TRIF檢測比較

表7 不同稀釋液對HBsAg和HBeAg ELISA檢測OD值變化的影響

3 討論

大量臨床報道，苦參素有良好的抗HBV作用，然而體外細胞實驗中，我們前期研究采用ELISA檢測HBsAg和HBeAg進行苦參生物堿抗HBV作用研究發(fā)現(xiàn)，苦參素雖有一定的抗HBV作用，但因半數(shù)有效濃度 (IC50/EC50)高于或接近半數(shù)毒性濃度(TC50)，而無法求出SI(選擇指數(shù))/TI(治療指數(shù))，似與臨床結(jié)果不一致［5］。最近我們采用ELISA檢測HBsAg和HBeAg進行白樺酯酸抗HBV作用研究，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與他人和我們以往研究結(jié)果相出入［6］，IC50和SI/TI均無法求出。同時，我們將樣品采用ABBOTT等試劑進行檢測發(fā)現(xiàn)，其結(jié)果表明白樺酯酸抑制HBeAg分泌的IC50與相關(guān)文獻相一致，SI/TI＞2。鑒此，為了對病毒療效評價提供準確信息，我們對基于ELISA檢測技術(shù)所得數(shù)據(jù)進行方法學(xué)研究。

將HepG2.2.15細胞株培養(yǎng)上清液進行梯度稀釋，采用ELISA進行HBsAg和HBeAg檢測，我們驚異地發(fā)現(xiàn)，對半稀釋的樣品 (1/2稀釋液，相當(dāng)于50%病毒抑制率，即IC50)其OD值與沒有稀釋的樣品 (原液)OD值極為接近。而有時OD值是原液OD值一半時的稀釋倍數(shù)已達3倍以上 (即病毒抑制率75%以上)，有的竟高達50倍 (即病毒抑制率98%)，說明以前采用病毒抑制率 (%)=(空白對照組平均OD值－藥物干預(yù)組平均OD值)/空白對照組平均OD值×100%這一作法完全低估了抗病毒藥物的作用。究其原因，可能是國內(nèi)研究人員誤將適用于線性相關(guān)的放免法檢測所得結(jié)果的此一計算方法移植于ELISA檢測所得結(jié)果的計算中［4，7］。

除樣品冰凍后復(fù)融實驗結(jié)果病毒濃度與OD值擬合曲線均呈S型外，不同批次試劑、同批次試劑不同批次實驗和其他不同樣品前處理的HBeAg ELISA檢測OD值均雖各不相同，病毒濃度與OD值擬合曲線雖均仍呈類似拋物線型，但ELISA檢測進行曲線擬合后，結(jié)果與化學(xué)發(fā)光免疫、時間分辨熒光免疫檢測結(jié)果相一致。不同稀釋液對HBsAg ELISA檢測具體OD數(shù)值有影響，但不影響曲線擬合類似拋物線型。因此，建議在今后采用ELISA檢測技術(shù)所得數(shù)據(jù)進行IC50計算的抗病毒藥物作用的療效評價中，采用含病毒樣品梯度稀釋制作標準曲線并進行曲線擬合，以便能正確計算IC50和SI/TI，為抗病毒療效評價提供準確信息。盡量不采用冰凍保存樣品的方法，或冰凍保存樣品采用合適稀釋，以便制作正確的標準曲線和正確檢測樣品中待檢物質(zhì)。

應(yīng)用不同的酶標儀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對HBsAg ELISA檢測采用濾光片檢測技術(shù)的酶標儀不僅OD值偏低，而且因最高濃度樣品OD值反低于其樣品倍半稀釋的OD值，致樣品濃度與OD值呈S線型關(guān)系，而全波長酶標儀其OD值與病毒濃(滴)度呈拋物線關(guān)系。因此我們認為如果采用濾光片檢測技術(shù)的酶標儀，建議對所有樣品進行適當(dāng)稀釋，以便制作正確的標準曲線和正確檢測樣品中待檢物質(zhì)。

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