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    低氧誘導肺動脈內皮細胞轉分化的初步機制研究

    2013-09-27 07:26:04胡義杰李志平陳建明鐘前進第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所心血管外科重慶400042
    局解手術學雜志 2013年6期
    關鍵詞:轉分化平滑肌低氧

    胡義杰,李志平,陳建明,沈 誠,宋 毅,鐘前進 (第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所心血管外科,重慶 400042)

    繼發(fā)性肺動脈高壓的主要病理學變化表現為表達α 平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)細胞在增厚的血管壁中大量堆積。但關于這些細胞的來源以及大量堆積的機制尚未完全明確[1]。有研究報道肺動脈血管壁中膜常駐平滑肌細胞去分化[2];肺血管外膜的成纖維細胞的分化[3-4];歸巢于血管損傷部位的循環(huán)祖細胞分化。因此這些表達α-SMA表型的成肌纖維細胞具有高度的異質性,其來源可能復雜多樣[5];這也可能是目前臨床藥物治療效果欠佳的重要原因。近年來有報道認為在腎臟纖維化和心肌纖維化過程中存在內皮細胞向平滑肌樣細胞或成肌纖維細胞的轉分化[6-7]。那內皮細胞的轉分化是否也是肺動脈高壓形成中肺動脈壁重塑的機制之一呢?因此本研究以低氧性肺動脈高壓為基本模型,細胞水平對低氧培養(yǎng)肺動脈內皮細胞表型變化及TGF-β1在此過程中的作用進行了探索。

    1 材料與方法

    1.1 肺動脈內皮細胞的原代培養(yǎng)

    健康6周左右SPF級SD大鼠(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動物房),皮下注射戊巴比妥鈉70 mg/kg麻醉。碘伏消毒固定大鼠的胸腹部。剪開下腹部腹腔,并沿正中線上延手術切口至頸部,同時打開腹腔和胸腔,暴露出心肺組織。前下提起心肺,剪斷主動脈;切除心臟,顯露主肺動脈和左右肺動脈干。順肺動脈干方向,切除肺組織和血管外膜,盡可能多的保留肺動脈并注意避免損傷肺動脈內膜。將PBS清洗的節(jié)段肺動脈血管,銳性切成小肺血管片。肺動脈內膜面貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Hyclone公司,美國)和支原體去除劑MRA 50 μl(Mpbio公司,美國)的 DMEM/F12培養(yǎng)基中,于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育。48~72 h后,去除血管片并繼續(xù)培養(yǎng)、傳代。選擇第3~4代狀態(tài)好的肺動脈內皮細胞繼續(xù)后續(xù)試驗。

    1.2 肺動脈內皮細胞的低氧培養(yǎng)誘導轉分化

    取對數生長期的肺動脈內皮細胞,做細胞爬片。將細胞爬片和處于對數生長期的細胞放入低氧培養(yǎng)箱(含1%O2、5%CO2、94%N2混合氣體)、37℃恒溫孵育。每兩天給細胞換液,并在低氧培養(yǎng)1 d、4 d、7 d時觀察細胞形態(tài),與常氧培養(yǎng)的細胞比較。低氧培養(yǎng)7 d結束后,細胞爬片用4%中性甲醛固定后4℃保存?zhèn)溆?。收取常氧培養(yǎng)和低氧培養(yǎng)的肺動脈內皮細胞,抽提總mRNA和總蛋白樣本并放-80℃保存?zhèn)溆?。取出固定的細胞爬片,PBS洗3次,用0.1%Triton通透15 min,再用PBS洗3次,anti-α-SMA孵育過夜,PBS洗3次后再孵育對應二抗1 h,PBS洗3次后DAB顯色3 min,用PBS洗去DAB后用中性樹脂封片。晾干后去照相。

    1.3 TGF-β1及其抑制劑調節(jié)轉分化實驗分組

    大鼠肺動脈內皮細胞在常氧培養(yǎng)下不同濃度TGF-β1及其抑制劑刺激后比較各組α-SMA蛋白表達差異。取對數生長期的細胞和細胞爬片,按下列條件分別給予刺激。刺激72 h后,抽提總蛋白樣本并放-80℃保存?zhèn)溆谩GF-β1刺激組:①正常對照;②1 ng/mL TGF-β1;③5 ng/mL TGF-β1;④10 ng/mL TGF-β1;⑤50 ng/mL TGF-β1。在最佳 TGF-β1 刺激濃度基礎上,設定TGF-β1/SD-208刺激分組:①低氧實驗組;②常氧組;③SD-208 0.5 μM 刺激組;④SD-208 0.5 μM+ 最佳濃度 TGF-β1刺激組;⑤最佳濃度TGF-β1刺激組。

    1.4 TGF-β1 mRNA、蛋白表達和 α-SMA 蛋白水平

    用Trizol一步法提取總RNA。反轉錄采用2 ug總RNA。常規(guī)RT-PCR分析TGF-β1 mRNA的水平。TGF-β1 cDNA的引物:上游引物5’-GCCCCTACATTTGGAGCCTG-3’,下游引物5’-CAGGAGCGCACGATCATGT-3’。內參 β-actin引物為:上游引物 5’-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3’,下游引物 5’-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3’。BCA法檢測總蛋白濃度。10%SDSPAGE膠電泳,電轉NC膜,封閉后加anti-TGF-β1抗體或antiα-SMA及對應的二抗免疫印跡檢測TGF-β1或α-SMA蛋白的表達。

    2 結果

    2.1 低氧原代培養(yǎng)肺動脈內皮細胞轉分化為平滑肌樣細胞

    肺動脈內皮細胞經貼壁純化和傳代培養(yǎng)后,呈現內皮細胞典型的鋪路石樣生長(圖1)。隨著低氧培養(yǎng)時間的延長,鋪路石樣內皮細胞逐步向多角形細胞改變。免疫細胞化學染色可見α-SMA高表達的平滑肌樣細胞改變(圖2)。

    2.2 TGF-β對肺動脈內皮細胞轉分化的影響

    低氧培養(yǎng)7 d細胞TGF-β1 mRNA表達水平和蛋白表達水平都高于正常氧濃度培養(yǎng)組(圖3)。隨著TGF-β1刺激濃度的增加,細胞表達α-SMA的水平逐步增加(圖4A)。10 ng/mL TGF-β1刺激可見α-SMA較前增加明顯,因此將其設為后續(xù)實驗的最佳刺激濃度。單純10 ng/mL TGF-β1刺激與低氧所致的α-SMA水平增加相似;在予以TGF-β1抑制劑SD-208后,可見α-SMA表達水平幾乎恢復正常;單獨的SD-208對α-SMA表達并無顯著影響。

    圖1 貼壁培養(yǎng)的肺動脈內皮細胞(×10倍)

    圖2 低氧培養(yǎng)7 d后肺動脈內皮細胞轉分化為α-SMA高表達的平滑肌樣細胞(×40倍)

    圖3 低氧培養(yǎng)7 d后細胞TGF-β1表達水平高于正常組

    圖4 不同刺激條件對肺動脈內皮細胞α-SMA表達的影響

    3 討論

    肺動脈高壓中重塑血管壁組織細胞來源和機制至今尚未完全明確。結合已有研究對心臟、腎臟血管內皮細胞轉分化現象的認識,本研究證實貼壁培養(yǎng)的肺動脈內皮細胞在低氧培養(yǎng)條件下,能向平滑肌樣細胞轉分化;且TGF-β1在低氧誘導的肺動脈內皮細胞轉分化過程中具有重要意義。

    穩(wěn)定培養(yǎng)肺動脈內皮細胞是研究其轉分化現象的基礎。目前肺動脈內皮細胞分離培養(yǎng),主要有酶消化法、切碎并酶消化法、磁珠分離法、組織貼壁培養(yǎng)法。本實驗采用了組織貼壁法。通過多次差速貼壁,呈鋪路石樣生長的內皮細胞相對純化,在第3~4代培養(yǎng)后純度約98%,為實驗的穩(wěn)定開展提供了基礎。

    近年來越來越多的證據提示成熟的血管內皮細胞存在轉分化現象。在心血管發(fā)育過程中,房室管區(qū)域內皮細胞表型(CD31)的心內膜細胞逐步分化為間質細胞的心內膜墊內皮細胞[8]。內皮細胞轉分化現象也是心肌纖維化、腎臟纖維化過程甚至腫瘤進展的重要機制之一。在Cre-lox基因標記的小鼠心肌纖維化模型中發(fā)現27%~33%的成纖維細胞起源于內皮細胞[7]。在多個腎臟纖維化模型中,近30% ~50%的成纖維細胞同時表達內皮細胞表型CD31和成纖維特異蛋白或α-SMA;而采用內皮細胞系示蹤系統(tǒng)證實內皮細胞轉分化[9]。在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用的成纖維細胞,其來源也可能與內皮細胞的轉分化相關[10]。本實驗證實肺動脈內皮細胞在低氧培養(yǎng)7 d后,鋪路石樣生長肺動脈內皮細胞向多角形的α-SMA高表達的平滑肌樣細胞轉分化。這種內皮細胞轉分化來源的細胞可能是血管壁重塑的重要機制之一。

    TGF-β1在機體的損傷修復、炎癥反應、組織纖維化和腫瘤血管形成等過程發(fā)揮重要作用。近來研究證實TGF-β1在心臟、腎臟等多種組織的內皮細胞轉分化過程中具有重要作用[9-11]。本研究證實低氧能上調TGF-β1的表達水平;而TGF-β1能刺激肺動脈內皮細胞向平滑肌樣細胞的轉分化,抑制TGF-β1能減少肺動脈內皮細胞的轉分化。故推測低氧性肺動脈高壓形成的機制是通過TGF-β1信號通路實現的。在其他內皮細胞轉分化模型中發(fā)現TGF-β1可能通過多種機制實現轉分化。心肌纖維化模型中,miR-125b能降低p53表達水平,抑制 TGF-β1介導的內皮細胞轉分化[12];單獨miR-21的過表達可以刺激內皮細胞的轉分化,而沉默miR21可以降低心肌纖維化[13]。rhBMP可以拮抗TGF-β1,減輕心肌纖維化[7]。在低氧性肺動脈高壓中TGF-β1調節(jié)肺動脈內皮細胞轉分化的機制尚需更深入的實驗予以闡明。

    我們的研究為肺動脈高壓異構肺血管壁來源和機制提供了實驗依據,對臨床防治肺動脈高壓提供了新思路。但TGF-β1在肺動脈內皮細胞轉分化過程的作用機制十分復雜,還有待進一步的研究才能全面闡明。

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