rFN/CDH-BCP組織工程骨的制備和體內(nèi)融合效應的初步研究

向 強，崔 翔，王加旭，劉明華 (第三軍醫(yī)大學:.西南醫(yī)院急救部;.新橋醫(yī)院骨科，重慶 400038)

雙嗜性分子重組纖維連接蛋白/鈣粘附蛋白(recombinant fibronectin/cadherin chimera，rFN/CDH)實現(xiàn)了對FN和CDH11功能學的疊加［1］，本實驗把該融合蛋白引入雙相鈣磷陶瓷(Biphasic calcium phosphate ceramic，BCP)表面復合bMSCs制備組織工程骨，利用細胞離心粘附實驗、MTT實驗和成骨誘導分化等方法觀察骨種子細胞的粘附和分化，并把其應用于兔腰椎橫突間植骨融合，觀察融合部位新骨生成狀況及種子細胞分布、轉(zhuǎn)歸狀況，為該組織工程骨的臨床研究和應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

rFN/CDH融合蛋白(實驗室自備)，方法見文獻［1］，多孔雙相鈣磷陶瓷(prous BCP)購于四川大學，DMEM/F12培養(yǎng)基，DTBP雙官交聯(lián)劑，MTT，胎牛血清，胰蛋白酶，TEMED，Trypsin，購于美國Sigma公司，ALP檢測試劑盒，細胞鈣含量檢測試劑盒(ARⅢ))，鈣結(jié)節(jié)染色試劑盒(茜素紅)購于南京建成生物材料有限公司。

1.2 bMSCs的分離和培養(yǎng)

選取健康7 d新西蘭大白兔仔兔(購于第三軍醫(yī)大學實驗動物中心)，收集雙側(cè)股骨干骺骨髓3 mL，采用密度梯度離心貼壁篩選法。離收集細胞，加入percoll細胞分離液，收集白膜層的單個核細胞，洗滌、離心后加入DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，按105～106/mL的密度接種于無菌50 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)。在37℃、50%CO2、飽和濕度恒溫細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 hr換液棄去未貼壁細胞，加入DMEM/F12培養(yǎng)基在37℃、50%CO2、飽和濕度恒溫細胞培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)。倒置像差顯微鏡下觀察細胞生長情況，每2～3 d換液1次，待細胞生長至3～6代、融合率達70%～80%時即可用以成骨誘導分化實驗。

1.3 bMSCs復合 rFN/CDH-BCP

將生長至第3代、融合率達70% ～80%的bMSCs以0.25%胰蛋白酶消化成細胞懸液，計數(shù)、離心，制成密度為107/mL的單細胞懸液。將rFN/CDH-BCP平鋪于12孔板塑料小皿底部，以每孔1 mL單細胞懸液(1×107個細胞/孔)加入各孔rFN/CDH-BCP表面，在37℃、50%CO2、飽和濕度恒溫細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，使細胞充分貼附于rFN/CDH-BCP表面。

1.4 動物模型建立

選取健康成年新西蘭大白兔16只(購于第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，雌雄不限)，麻醉成功后消毒鋪巾，定位L4～L5間隙，后正中切口切開皮膚全層暴露至椎旁2～3 cm，暴露L4、L5橫突，打磨制備植骨床。每組隨機選取8只大白兔，分別將單純BCP材料(BCP植入組)或bMSCs復合rFN/CDH-BCP材料(bMSCs-BCP組織工程骨組)植入骨床處。術(shù)后3 d每日注射青霉素鈉40萬單位，每日2次。

1.5 指標檢測

bMSCs復合rFN/CDH-BCP 24 h后，利用MTT實驗、掃描電鏡、熒光染色等方法觀察骨種子細胞的粘附、增殖和分化。利用X線影像學和組織學技術(shù)觀察融合部位新骨生成狀況及種子細胞分布、轉(zhuǎn)歸情況。

1.5.1 bMSCs增殖率和活力檢測 將BCP界面消毒、預濕后，置于96孔細胞培養(yǎng)板，取bMSCs單細胞懸液(第3～6代)，以每孔2 000的初密度接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、5%CO2、適度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～9 d，隔日換液1次;每日行MTT檢測，酶標儀檢測并記錄各孔OD值(檢測波長570 nm)。

1.5.2 描電鏡觀察 在rFN/CDH-BCP界面上將300μl bMSCs細胞懸液以1 000/片的初密度接種，復合24 h，持續(xù)培養(yǎng)48 h后取出載有bMSCs的rFN/CDH-BCP，經(jīng)PBS液漂洗后3%戊二醛固定2 h，梯度酒精脫水，真空干燥8 h，真空鍍膜儀噴金鍍膜后SEM檢測觀察。

1.5.3 熒光染色 加入0.5mg/mL的Hoechst 33342母液培養(yǎng)至3～6代，密度為105/mL的bMSCs單細胞懸液，避光冰浴20 min，細胞標記后細胞以100 μl/孔的體積(104個細胞/孔)加入96孔培養(yǎng)板各孔BCP表面，避光，胰酶消化，記錄各孔熒光強度，置于細胞培養(yǎng)箱貼壁2～4 hr，熒光倒置顯微鏡觀測記錄，并用Viewfinder圖像分析軟件分析。

1.5.4 rFN/CDH-BCP界面細胞ALP活性測定 取各組誘導培養(yǎng)10 d的hMSCs，消化、離心、收集，加入細胞裂解液，吹打混勻，反復 －70℃急凍和37℃融化3次，超聲破碎，離心12 000 r/min，1℃低溫離心15 min，收集上清檢測。

1.5.5 rFN/CDH-BCP界面細胞鈣結(jié)節(jié)染色 采用茜素紅法，取誘導培養(yǎng)14 d的hMSCs制成單細胞懸液(1×105/mL)，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，7 d后棄培養(yǎng)液，依次進行GENMED固定，清理、染色，脫水，澄清，最后加入GENMED透亮液，光鏡下觀察。

1.5.6 X線觀察 術(shù)后1 d、1個月、3個月將兔麻醉后俯臥位、側(cè)位攝片，拍攝X線片，判斷各組材料在體內(nèi)成骨趨勢和融合情況、對比成骨差異。

1.5.7 組織學檢測 動物處死后，完整留取實驗融合部位組織塊，置入中性福爾馬林溶液中固定72 h，梯度酒精脫水，MMA包埋，硬組織切片機切片，HE染色和甲苯胺藍染色。

1.6 統(tǒng)計學分析

利用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差()的形式表示，采用獨立樣本t檢驗分析各組有無統(tǒng)計學差異及其有效性，P＜0.05為顯著統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡下骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學觀察:原代bMSCs培養(yǎng)72 h換液后，即可觀察到貼壁細胞，細胞形態(tài)短小，呈長梭型、紡錘形，培養(yǎng)至7 d，細胞明顯增多、變長、變大，長梭型、紡錘形形態(tài)更加明顯，14 d時，細胞基本鋪滿皿底，細胞排列呈螺旋狀或漩渦狀。傳代培養(yǎng)中，細胞基本保持長梭型的形態(tài)(圖1)。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學觀察

2.2 bMSCs增殖率和活力的測定

bMSCs與rFN/CDH-BCP復合7 d內(nèi)測定細胞活力，繪制bMSCs增殖曲線圖顯示:rFN/CDH-BCP界面的增殖率和細胞活力在前7 d的培養(yǎng)時間內(nèi)，明顯高于陰性(BCP組)和陽性(FN-BCP組，CDH-BCP組)對照組(P＜0.05)，表現(xiàn)為 MTT還原產(chǎn)物溶液的吸光度顯著高于對照組，7 d以后各組吸光度無明顯差異(圖2)。

2.3 掃描電鏡觀察結(jié)果

掃描電鏡觀察顯示，在hMSCs與rFN/CDH-BCP復合界面有大量細胞粘附，細胞充分伸展充分，呈多邊形狀或圓盤狀，偽足樣結(jié)構(gòu)減少，形成致密的板層樣結(jié)構(gòu)覆蓋在材料表面，如圖中箭頭所示。在單純BCP界面，細胞伸展不良，呈條索狀，可見大量偽足樣結(jié)構(gòu)深入材料孔隙內(nèi)(圖3)。

圖2 bMSCs增殖曲線圖

圖3 rFN/CDH-BCP界面對hMSCs生長形態(tài)的影響

2.4 bMSCs粘附性測定。

細胞離心粘附實驗顯示在rFN/CDH-BCP界面，隨著rFN/CDH密度的增加，粘附的細胞數(shù)亦逐漸增多。rFN/CDH-BCP表面明顯優(yōu)于陽性對照CDH-BCP和FN-BCP組，同時熒光顯微鏡下觀測也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果(圖4)。

2.5 rFN/CDH-BCP界面ALP活性測定

ALP活性測定顯示在rFN/CDH-BCP表面的ALP活性表現(xiàn)最高，顯著高于陰性對照和陽性對照組，提示復合了bMSCs的rFN/CDH-BCP組織工程骨的成骨活性增強(圖5)。

2.6 rFN/CDH-BCP界面細胞鈣結(jié)節(jié)染色

茜素紅法檢測成骨誘導后向細胞間鈣結(jié)節(jié)形成情況顯示，各組細胞間均有卵圓形、橘紅色均染的結(jié)節(jié)斑，以rFN/CDHBCP表面細胞形成最多，分布最廣，提示復合了bMSCs的rFN/CDH-BCP組織工程骨能促進bMSCs的成骨分化(圖6)。

圖4 bMSCs在不同BCP處理表面粘附測定

圖5 bMSCs在不同處理因素BCP表面的ALP活性變化

圖6 bMSCs在不同處理因素BCP表面的鈣結(jié)節(jié)形態(tài)(茜素紅染色后鈣結(jié)節(jié)差異性表達)

2.7 X線檢測

術(shù)后3個月X線檢測顯示，單純BCP移植組與橫突間未見明顯愈合，BCP材料依然清晰可見。bMSCs+rFN/CDH-BCP組織工程骨移植組橫突間及周圍已形成大量纖維骨痂結(jié)構(gòu)，材料與橫突周圍骨質(zhì)融為一體，界限模糊(圖7)。

圖7 組織工程骨植入后橫突間腰椎融合的X線放射學評價

雙盲法評估融合動物數(shù)量和橫突間隙骨痂填充率結(jié)果顯示:bMSCs復合rFN/CDH-BCP組織工程骨移植組達到100%融合率，單純BCP移植組融合率為40%。組織工程骨移植組橫突間隙的骨痂填充率也明顯優(yōu)于BCP組(P＜0.01)，提示其誘導新骨形成的能力增強(表1)。

表1 影像學表現(xiàn)下定量評估體內(nèi)骨愈合效果(，n=5)

表1 影像學表現(xiàn)下定量評估體內(nèi)骨愈合效果(，n=5)

*:與 BCP 組比較，P ＜0.01

2.8 組織學觀察

組織學觀察顯示，單純BCP植入組材料－骨床交界區(qū)以軟骨組織為主，新生骨成熟度較低，材料與骨床間無骨性融合和鈣化，組織學分級以軟骨組織為主。bMSCs復合rFN/CDH-BCP組植入組織學表現(xiàn)為融合區(qū)域出現(xiàn)成熟度較高的骨小梁交錯性橋接與材料融為一體，HE和甲苯胺藍染色均有特征性表現(xiàn)，顯示成骨能力顯著強于單純BCP植入組(圖8)。

圖8 復合bMSCs的rFN/CDH-BCP和單純BCP植入3個月的組織學觀察

3 討論

目前多樣化的骨替代材料，尤其是組織工程材料表現(xiàn)出了一定的臨床應用前景，但由于材料本身特性單一，缺乏特定的結(jié)構(gòu)和分子信號，影響了細胞粘附到材料上的效率，并由此限制了隨后的材料－組織界面的骨誘導和骨生成作用［2］。為嘗試解決這一難題，我們把兼有纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)和鈣粘附蛋白(Cadherin，CDH)功能特點的雙嗜性rFN/CDH融合蛋白引入多孔的雙相鈣磷陶瓷(Biphasic calcium phosphate ceramic，BCP)表面，以期獲得一種在體外具有高效粘附性和良好促進骨種子細胞成骨分化潛能的生物界面，并對其實際應用價值進行評估。

細胞在材料界面的粘附與細胞遷移、增殖、分化，基質(zhì)沉積、血管芽生成，材料降解等息息相關(guān)［3］，細胞在材料表面的粘附特性是衡量材料生物相容性的一個重要指標。在實驗中，我們采用離心促粘附實驗檢測了bMSCs在rFN/CDH-BCP界面的粘附狀況。離心促粘附實驗是通過適當?shù)碾x心力促進細胞與材料的結(jié)合/脫離，用熒光標記的方法對有效粘附的細胞進行計數(shù)，具有準確、簡捷、可控、假陽性率低的優(yōu)勢［4］。結(jié)果表明在BCP界面上粘附的hMSCs數(shù)量與rFN/CDH的密度成正相關(guān)，明顯高于單純BCP和FN、CDH修飾的BCP界面，證實了rFN/CDH修飾后的BCP界面對bMSCs的粘附能力明顯增強。

單純BCP材料對于細胞增殖無明顯影響［5］，為驗證bMSCs在rFN/CDH-BCP界面的活力和增殖能力，我們采用了MTT檢測法，MTT代謝產(chǎn)物的量與細胞數(shù)量和活力呈正相關(guān)。實驗結(jié)果顯示:rFN/CDH-BCP表面bMSCs的MTT代謝產(chǎn)物的量顯著增加，明顯高于單純BCP材料組，提示bMSCs在rFN/CDH-BCP表面的增殖率和細胞活力明顯優(yōu)于單純BCP材料。實驗通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在rFN/CDH-BCP材料的表面有大量bMSCs，細胞充分伸展充分，呈多邊形狀或圓盤狀，偽足樣結(jié)構(gòu)減少，形成致密的板層樣結(jié)構(gòu)覆蓋在材料表面。而單純BCP表面bMSCs少，細胞伸展不良，呈條索狀，可見大量偽足樣結(jié)構(gòu)深入材料孔隙，此結(jié)果有效地說明了rFN/CDH-BCP界面能增強種子細胞的活力和增殖能力。

ALP是成骨分化的早期標志物為，茜素紅染色法檢測成骨誘導后細胞間鈣結(jié)節(jié)形成是評價成骨終末作用的有效指標［5］。實驗結(jié)果顯示rFN/CDH-BCP界面上bMSCs誘導10 d后ALP活力檢測已明顯增高，是單純BCP組的8.7倍(P ＜0.05)，由此說明rFN/CDH-BCP界面具有促進種子細胞早期成骨分化的作用。實驗中把誘導21 d的bMSCs在體外繼續(xù)培養(yǎng)7 d，檢測成骨誘導后向細胞間的鈣結(jié)節(jié)形成情況顯示rFN/CDH-BCP表面的細胞間質(zhì)中存在大量的橘紅色鈣結(jié)節(jié)，提示此時進入基質(zhì)礦化期，表明rFN/CDH-BCP表面具有更強信號以促進分化成熟的成骨細胞礦化。

材料在生物體內(nèi)是涉及成千上萬的信號分子效應蛋白和一系列胞內(nèi)和ECM級聯(lián)反應的復雜過程［6］，通過組織學檢測則可對組織－材料界面上的基質(zhì)礦化、骨質(zhì)沉積和新骨形態(tài)進行全面的了解［7］。把復合bMSCs的rFN/CDH-BCP組織工程骨用于兔腰椎橫突間融合術(shù)后取材，X線檢測顯示，單純BCP移植組與橫突間未見明顯愈合，BCP材料依然清晰可見。bMSCs+rFN/CDH-BCP組織工程骨移植組橫突間及周圍已形成大量纖維骨痂結(jié)構(gòu)，材料與橫突周圍骨質(zhì)融為一體，界限模糊為。組織學切片發(fā)現(xiàn)單純BCP植入組材料－骨床交界區(qū)以軟骨組織為主，新生骨成熟度較低，材料與骨床間無骨性融合和鈣化，組織學分級以軟骨組織為主。bMSCs復合rFN/CDH-BCP組植入組織學表現(xiàn)為融合區(qū)域出現(xiàn)成熟度較高的骨小梁交錯性橋接與材料融為一體，HE和甲苯胺藍染色均有特征性表現(xiàn)，顯示成骨能力顯著強于單純BCP植入組。實驗結(jié)果顯示，bMSCs+rFN/CDH-BCP組織工程骨具有促進成骨細胞粘附和成骨的良好生物學效應，在體內(nèi)表現(xiàn)出了良好的骨傳導和骨誘導特性，是一種有廣闊應用前景的骨修復材料。

［1］Zhang Y，Zhou Y，Zhu J，et al.Effect of a novel recombinant protein of fibronectinIII7-10/cadherin 11 EC1-2 on osteoblastic adhesion and differentiation［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2009，73(9):1999 －2006.

［2］Green DW，Watson GS，Watson J，et al.New biomimetic directions in regenerative ophthalmology［J］.Adv Healthc Mater，2012，1(2):140 －148.

［3］Krauss Juillerat F，Borcard F，Staedler D.Functionalization of microstructured open-porous bioceramic scaffolds with human fetal bone cells［J］.Bioconjug Chem，2012，23(11):2278 －2290.

［4］Reyes CD，García AJ.A centrifugation cell adhesion assay for highthroughput screening of biomaterial surfaces［J］.J Biomed Mater Res A，2003，67(1):328 －333.

［5］Li B，Chen X，Guo B，et al.Fabrication and cellular biocompatibility of porous carbonated biphasic calcium phosphate ceramics with a nanostructure［J］.Acta Biomater，2009，5(1):134 － 143.

［6］Fini M，Giavaresi G，Torricelli P，et al.Osteoporosis and biomaterial osteointegration［J］.Biomed Pharmacother，2004，58(9):487 －493.

［7］Magit DP，Maak T，Trioano N，et al.Healos/recombinant human growth and differentiation factor-5 induces posterolateral lumbar fusion in a New Zealand white rabbit model［J］.Spine(Phila Pa 1976)，2006，31(19):2180－2188.