歐洲花楸細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長動力學(xué)研究△

肖文娟，楊光，郭蘭萍，郝慶秀，林淑芳

(中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700)

中藥農(nóng)業(yè)

歐洲花楸細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長動力學(xué)研究△

肖文娟，楊光，郭蘭萍*，郝慶秀，林淑芳

(中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700)

目的：探討歐洲花楸懸浮細(xì)胞生長規(guī)律和動力學(xué)參數(shù)。方法：測定歐洲花楸懸浮細(xì)胞生物量及細(xì)胞懸浮液pH值變化；利用細(xì)胞鮮重和干重值對歐洲花楸懸浮細(xì)胞生長曲線進行擬合，用數(shù)學(xué)建模模擬歐洲花楸懸浮細(xì)胞增殖情況，并對擬合函數(shù)求一階、二階導(dǎo)數(shù)，求算歐洲花楸懸浮細(xì)胞生長速率及生長加速度。結(jié)果：歐洲花楸懸浮細(xì)胞液的pH值隨培養(yǎng)時間增加而越來越大，培養(yǎng)時間到16 d，pH>6,不再適宜細(xì)胞生長；Logistic模型能夠描述歐洲花楸懸浮細(xì)胞生長曲線變化。培養(yǎng)第5d時細(xì)胞增長加速度達(dá)到最大，在8 d時生長速率達(dá)到最大，結(jié)論：歐洲花楸懸浮細(xì)胞生長函數(shù)符合logistic曲線，函數(shù)為f(x)=0.369 9/(1+10.77e-0.329 2x)，細(xì)胞在14 d時進入增長平臺期，在細(xì)胞生長至第5 d時可進行誘導(dǎo)子處理。

歐洲花楸；懸浮細(xì)胞；數(shù)學(xué)建模；Logistic函數(shù)模型；細(xì)胞懸浮液pH值

歐洲花楸(SorbusaucupariaL.)為薔薇科花楸屬落葉喬木或小喬木，原產(chǎn)歐洲和亞洲西部溫帶高山區(qū)域[1]。含有多酚、花青素、黃酮類等活性成分[2]。其果實、枝葉及莖皮皆可入藥。果實收斂、利尿，葉子通便祛瘀[3-5]，是治療腎病、痛風(fēng)、風(fēng)濕、感冒和凈化血液的良藥[6]。作為植物藥，歐洲花楸需要生長一定時間后方可入藥，且植株中的藥用成分含量低、產(chǎn)量及質(zhì)量不穩(wěn)定。用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)藥用次生代謝產(chǎn)物，是目前生物技術(shù)重要的研究發(fā)展領(lǐng)域。本文以歐洲花楸懸浮細(xì)胞為材料，研究其生長特性及次生代謝產(chǎn)物的積累情況，并對細(xì)胞生長動力學(xué)做了初步研究，為利用該細(xì)胞進行實驗優(yōu)化控制和規(guī)模生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物提供參考。

1 材料

歐洲花楸懸浮細(xì)胞系由中國科學(xué)院植物研究所葉和春研究員贈送。

2 儀器與試劑

儀器：培養(yǎng)箱(Conviron Adaptis CMP6010)；搖床(TCYQ超大型搖床)；電子天平(Sartorius BS 2202S)；超凈工作臺(SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺)；分析型酸度計(JENWAY 3510)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI Rotavapor R-200)；高效液相色譜儀(Waters 2695_2996)；其它常規(guī)設(shè)備。

試劑：甲醇(色譜純，F(xiàn)isher Chemical生產(chǎn))；乙酸乙酯、甲醇、甲酸等(均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))。

3 實驗方法

3.1 愈傷組織的培養(yǎng)

誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于含50 mL MS固體培養(yǎng)基的400 mL廣口瓶中，置于25 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，每14 d繼代1次。

3.2 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立

愈傷組織經(jīng)過3～5次繼代后，將生長旺盛、結(jié)構(gòu)疏松、易于分散的組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中，置于搖床上進行懸浮培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為120 rmp，培養(yǎng)溫度為25 ℃，避光培養(yǎng)，得到含單細(xì)胞或小細(xì)胞團的培養(yǎng)物繼代，繼代接種量為1.4 g，于20 mL的MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

3.3 細(xì)胞懸浮液pH值測定

采用分析型酸度計直接測定。

3.4 細(xì)胞增值測定

將培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞用蒸餾水沖洗3遍，真空抽濾至不滴水，直接稱量細(xì)胞鮮重，用鮮重(FCW)表示，每個處理重復(fù)4次，結(jié)果為4次的平均值。將收獲后的細(xì)胞在80 ℃烘箱中干燥過夜，至恒重，稱量得到細(xì)胞干重，用(DCW)表示。取樣時間間隔為1 d。

3.5 細(xì)胞生長曲線建模方法

根據(jù)歐洲花楸懸浮細(xì)胞生長曲線，構(gòu)建Logistic、Gompertz和Gauss模型，利用R2值確定最佳擬合模型，并利用matlab2010b軟件，由篩選得到生長曲線函數(shù)中求得細(xì)胞最大增長速度及加速度參數(shù)，

3.6 細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物提取和檢測方法

將收獲的細(xì)胞用15 mL甲醇在研缽中研碎，過濾到雞心瓶中，過濾后的細(xì)胞殘渣再用10 mL甲醇提取一次，合并濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干。培養(yǎng)基用15 mL乙酸乙酯萃取兩次，用分液漏斗將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至干，后用500 μL的甲醇溶解，0.45 μm濾膜過濾，用于HPLC檢測。

HPLC測定條件為：4.6×150 mmC18(5 μm)reverse column；流動相為水(0.1%甲酸)：甲醇(50∶50)流速0.7 mL·min-1；全波長紫外檢測。

4 結(jié)果

4.1 歐洲花楸懸浮細(xì)胞液pH值變化

在正常培養(yǎng)條件下，歐洲花楸細(xì)胞懸浮液的pH值隨著培養(yǎng)時間的延長而增大。細(xì)胞培養(yǎng)基初始pH值為4.14，在細(xì)胞繼代培養(yǎng)1 d后，pH值就升高至4.35。在1～15 d時，細(xì)胞懸浮液的pH值緩慢升高；當(dāng)生長時間<17 d時，細(xì)胞懸浮液的pH值<6；當(dāng)生長時間>17 d時，細(xì)胞懸浮液的pH值>6(見圖1、表1)。

圖1 歐洲花楸懸浮細(xì)胞液pH值變化曲線

4.2 歐洲花楸懸浮細(xì)胞生長曲線

歐洲花楸懸浮細(xì)胞鮮重和干重的生長曲線均為S型，1～5 d內(nèi)細(xì)胞生物量增加較慢；在5～14 d時，細(xì)胞鮮重快速增加；在14 d之后，細(xì)胞鮮重量下降；在17～20 d時，細(xì)胞鮮重漸趨穩(wěn)定，此時細(xì)胞進入生長穩(wěn)定期。在14 d時，細(xì)胞鮮重量達(dá)到最大值，為5.29 g/瓶，是初始接種量的8.8倍(見表1、圖2及圖3)。以上實驗結(jié)果表明，歐洲花楸懸浮細(xì)胞的動力學(xué)特性表現(xiàn)：繼代后0～5 d是細(xì)胞的延滯生長期，5～14 d是細(xì)胞的指數(shù)生長期，14～20 d細(xì)胞處于穩(wěn)定生長期。在14 d時細(xì)胞的鮮重達(dá)到最大值，即細(xì)胞在14 d之前生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)及生長空間是充足的，細(xì)胞增量不受環(huán)境因子限制。

圖2 歐洲花楸懸浮細(xì)胞鮮重增長曲線

圖3 歐洲花楸懸浮細(xì)胞干重增長曲線

表1 歐洲花楸懸浮細(xì)胞生長20d的生物量及細(xì)胞懸浮液的pH值(n=4)

4 建模與分析

采用結(jié)構(gòu)模型來描述植物細(xì)胞的生長與次生代謝產(chǎn)物的代謝，通過測定與分析細(xì)胞內(nèi)組分的變化，能夠更深入地研究植物細(xì)胞培養(yǎng)的內(nèi)在規(guī)律。根據(jù)模型的描述，針對細(xì)胞所處的培養(yǎng)不同階段，采取不同的優(yōu)化培養(yǎng)策略，從而分別滿足細(xì)胞生長和產(chǎn)物代謝的需要，實現(xiàn)對整個培養(yǎng)體系的優(yōu)化操作。對于S型細(xì)胞的生長曲線，人們通常用Logistic模型來描述。但是Logistic模型只能描述環(huán)境條件變化對生物種群實際增長率的影響。故本實驗選擇了Logistic、Gompertz和Gaussian三種模型進行擬合，通過比較其R2值，確定最適擬合歐洲花楸懸浮細(xì)胞生長曲線的函數(shù)模型，探討其生長規(guī)律，為進行實驗優(yōu)化控制提供依據(jù)。

4.1 生長曲線函數(shù)模型

從細(xì)胞鮮重及干重的擬合結(jié)果中可知，歐洲花楸懸浮細(xì)胞生物量的增長符合Logistic模型，細(xì)胞干重擬合的函數(shù)擬合度最高(見表2)，歐洲花楸懸浮細(xì)胞的生長函數(shù)為：f(x)=0.369 9/(1+10.77e-0.329 2x)，擬合曲線的R2=0.969，對該函數(shù)作圖(見圖4)。可知，Logistic模型能夠很好地反映歐洲花楸懸浮細(xì)胞生長的各個階段： 1～5 d為細(xì)胞延滯生長期，5～14 d為細(xì)胞指數(shù)生長期，在17天時已基本到達(dá)函數(shù)的平臺期，17 d之后細(xì)胞處于穩(wěn)定生長期。

表2 模擬歐洲花楸懸浮細(xì)胞生長函數(shù)參數(shù)值

圖4 擬合生長曲線的Logistic函數(shù)圖像

4.2 細(xì)胞增長模型求解關(guān)鍵點

將擬合方程的參數(shù)代入f(x)=b/(1+ae-kx)中，得到下式：

f(x)=0.369 9/(1+10.77e-0.329 2x)

因為Logistic函數(shù)表達(dá)的是細(xì)胞增長的累積量，為了研究歐洲花楸懸浮細(xì)胞增長函數(shù)，須對模擬的Logistic函數(shù)進行求導(dǎo)。

利用matlab2010b軟件，調(diào)用diff函數(shù)對f(x)進行求一階導(dǎo)數(shù)，得到函數(shù)f(x)=5 720 058 669/[125 000 000e0.388 7x(1 167/(50e3 887x+1)2]

對該函數(shù)進行作圖(見圖5)。從圖中可以看到，歐洲花楸懸浮細(xì)胞增長表現(xiàn)出先增加，后降低的趨勢，表明在歐洲花楸懸浮細(xì)胞培養(yǎng)前期，細(xì)胞增長不受環(huán)境約束，細(xì)胞增長達(dá)到峰值后，環(huán)境抑制開始大于細(xì)胞增長動力。

對上述函數(shù)求極值，當(dāng)f(x)=0時，得到x=-[10 000 lg(50/1 167)]/3 887求解后的值極為最大增長速率，細(xì)胞生長速率變化趨勢是先增大后減小，在第8天時細(xì)胞增長速率最大。

為了研究歐洲花楸懸浮細(xì)胞增長加速度和細(xì)胞增長關(guān)鍵點，對模擬Logistic函數(shù)求二階導(dǎo)數(shù)并作圖(見圖6)。可知，細(xì)胞增長加速度呈現(xiàn)出先增加后減小的變化趨勢，在第5天時細(xì)胞增長加速度達(dá)到最大值。

圖5 Logistic函數(shù)一階導(dǎo)數(shù)的函數(shù)圖形(細(xì)胞增長速率)

圖6 Logistic函數(shù)二階導(dǎo)數(shù)的函數(shù)圖形(細(xì)胞增長加速度)

5 細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物檢測

在正常培養(yǎng)條件下，對培養(yǎng)了1 d、3 d、10 d，20 d，30 d，35 d的歐洲花楸懸浮細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物進行HPLC檢測，結(jié)果表明在細(xì)胞內(nèi)均未檢測到次生代謝產(chǎn)物。這與其他的藥用植物不同，例如黃芩[7]、人參[8]、丹參[9]、紫草[10]、南方紅豆杉[11]等藥用植物細(xì)胞系在正常培養(yǎng)條件下就可合成次生代謝產(chǎn)物。

6 討論

細(xì)胞材料相比于植株材料，有生長快、容易培養(yǎng)、影響條件易于控制等優(yōu)點。在植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物過程中，細(xì)胞生長規(guī)律、次生代謝產(chǎn)物合成和積累規(guī)律，對于植物細(xì)胞培養(yǎng)的進一步放大，提高次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)率等方面具有重要意義。細(xì)胞懸浮液pH值變化反映了培養(yǎng)基成分改變和細(xì)胞膜透性及酶活性改變。由歐洲花楸懸浮細(xì)胞生長曲線可知，細(xì)胞懸浮液的pH隨著培養(yǎng)時間增加而逐漸增大，在繼代0～14 d，細(xì)胞懸浮液pH值<6.0，17 d之后，pH值>6，培養(yǎng)基已不適合細(xì)胞生長。

了解細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下的動力學(xué)特性，是研究利用該細(xì)胞的首要條件。常規(guī)培養(yǎng)條件下歐洲花楸懸浮細(xì)胞的鮮重、干重生長曲線變化，是模擬歐洲花楸懸浮細(xì)胞生長函數(shù)的基礎(chǔ)。歐洲花楸懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的動力學(xué)特性表現(xiàn)為，在繼代后的0～5 d，是細(xì)胞延滯生長期；在5～14 d時，是細(xì)胞指數(shù)生長期；在14～20 d時，細(xì)胞處于穩(wěn)定生長期。在14 d時，細(xì)胞鮮重達(dá)到最大值，第5 d時細(xì)胞增長加速度達(dá)到最大，在8 d時生長速率達(dá)到最大，在細(xì)胞生長至第5 d可進行誘導(dǎo)子處理。

次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生是植物在長期進化過程中與環(huán)境相互作用的結(jié)果，這些次生代謝物的合成與植物體狀態(tài)和環(huán)境條件有密切聯(lián)系。不同類型的次生代謝產(chǎn)物，其生物合成途徑也不相同。薔薇科蘋果亞科的次生代謝產(chǎn)物是聯(lián)苯類和二苯呋喃類物質(zhì)，在植株的邊材部分合成，作為化學(xué)防御措施以抵御各種脅迫。有報道，當(dāng)歐洲花楸的葉子受到真菌感染時，植物組織合成了抗真菌類病害的植保素[12]。歐洲花楸為抵抗生物和非生物脅迫在葉子中合成聯(lián)苯歐洲花楸素[13]。也有資料表明，在用酵母提取物處理后，歐洲花楸懸浮細(xì)胞會很快合成并積累aucuparin[14]。而在本實驗培養(yǎng)和檢測條件下，對培養(yǎng)1 d、3 d、10 d、20 d、30 d、35 d的歐洲花楸懸浮細(xì)胞進行次生代謝產(chǎn)物檢測，均未檢測到聯(lián)苯類物質(zhì)。在使用其他特定環(huán)境因子誘導(dǎo)下，歐洲花楸懸浮細(xì)胞是否合成聯(lián)苯類次生代謝產(chǎn)物，還需要深入研究。

致謝：感謝北京市中藥學(xué)重點學(xué)科資助。

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StudyontheGowthKineticsofSorbusSucupariaL.inSuspensionCulturedCells

XIAO Wen-juan，YANG Guang，GUO Lan-ping，HAO Qing-xiu，LIN Shu-fang

(InstituteofChineseMateriaMedica，AcademyofTraditionalChineseMedicine，Beijing100700，China)

Objective： We want to make a model of the Cell Suspension Culture ofSorbusaucupariaL.and obtain the Kinetics parameters.Methods：The growth cycle of 20 d and the pH value of cells suspension liquid ofSorbusaucupariawas measured under normal culture conditions.The growth curve of suspension cultured cells ofSorbusaucupariawas fit by using the fresh weight and dry weight of cells.The growth cycle of suspension cultured cells ofSorbusaucupariawas determined by Logistic function model.Results：The pH of cell suspension increased overtimeobviously during 0～14 d.When the pH of suspension cultured cells is over 6，this is not suitable for the growth of cells.The Logistic function model can fit the change of the growth curve of suspension cultured cells ofSorbusaucuparia.The best growth rate and growth acceleration of suspension cultured cells ofSorbusaucupariais 5 d and 8 d respectively.Conclusion:The function of growth characteristics of suspension cultured cells ofSorbusaucupariaisf(x)=0.369 9/(1+10.77e-0.329 2x).SorbusaucupariaL.cells growth plateau occurson the 14 th day，and reach the fastest speed on the 8th day.Elicitors could be used on the fifth day.

Suspension cultured cells ofSorbusaucupariaL.;Mathematical model;Logistic function model;pH of cell suspension liquid

2012-12-18)

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國家自然科學(xué)基金(81130070，81072989)，國家中醫(yī)藥管理局行業(yè)科研專項(201107009)，國家科技重大專項(2009ZX09502-026，2009ZX09301-005)；中國中醫(yī)科學(xué)院課題ZZ20090302；中國南非合作項目(2009DFA31660)

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郭蘭萍，Tel：(010)64011944，E-mail：glp01@126.com