可注射神經生長因子緩釋制劑的體外釋藥性能

于海龍，項良碧，周大鵬，田競，畢巖

可注射神經生長因子緩釋制劑的體外釋藥性能

于海龍，項良碧，周大鵬，田競，畢巖

目的：觀察可注射神經生長因子（NGF）緩釋制劑的一般性質和體外釋藥特征。方法：采用藥物微球技術制備的NGF微球，與生物纖維蛋白膠混合形成NGF復合緩釋制劑，并通過體外釋放率和PC12細胞活性考察其體外釋藥性質。結果：體外實驗證明，NGF復合緩釋制劑可持續(xù)釋放NGF達7周以上，累積釋放率為63.85%，釋出的NGF可促進PC12細胞分化，具有較強的生物學活性，出現(xiàn)神經突觸樣生長。結論：制備可注射NGF緩釋制劑，可長期釋放NGF，并具有生物活性，可作為補充外源性NGF的良好制劑。

神經生長因子；組織粘著劑；PC12細胞

神經生長因子（nerve growth factor，NGF）是神經再生微環(huán)境中的重要成分，可維持神經元存活和促進軸突再生。研究表明軸突伸展需要NGF對于生長錐直接的刺激，局部的NGF可決定神經生長方向[1]。修復周圍神經損傷時，補充外源性NGF，可提高修復效果[2-4]。但NGF活性半衰期較短[5]，在水溶液中活性丟失快，易受濕度、酸堿度等多種因素的影響，全身應用將被快速滅活，局部穿刺分次給藥又無法保證每次釋藥部位的準確性。藥物的微球化技術能維持NGF活性并可持續(xù)釋放[6]，但在實際應用中仍存在一些問題，如微球制劑早期會出現(xiàn)藥物突釋，局部應用難以固定微球。因此，筆者研究一種可注射NGF緩釋制劑，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

NGF（小鼠2.5 S，商品名為蘇肽生，購于舒泰神公司）；纖維蛋白膠（購于廣州倍繡生物技術有限公司）；高速低溫離心機（購于上海天美公司）。

1.2 方法

1.2.1 可注射NGF緩釋制劑的制備 聚乳酸/乙醇酸共聚物150mg溶于1m L的二氯甲烷溶液中形成油相，NGF 30μg和適量的牛血清白蛋白加入油相，冰浴超聲分散均勻后加入10m LPBS溶液（含2%聚乙烯醇），高速勻漿 30 s，800 r/m in，攪拌 4 h，過濾，洗滌，真空凍干。將凍干微球封存于1m L玻瓶，將玻瓶置于60Co源下進行2.5×104G輻照滅菌1 h。將NGF微球放置在纖維蛋白膠的抑胰肽酶溶液中，與凝血酶溶液混合形成凝固物，NGF微球在聚合材料中的最終濃度為10mg/m L。

1.2.2 可注射NGF緩釋制劑體外釋放NGF曲線的測定 將1m L可注射NGF緩釋制劑靜置在5m L PBS（pH=7.4）中，放置37℃水浴溫箱，分別在 2、4、6、12、24 h，2、4、7、10、14、21、28、35、42、49 d 時取出，高速低溫離心機上以1 500 r/m in離心5min后，取上清液2m L放入－20℃冰箱冷凍保存，其余連同沉淀并補充等量的新鮮PBS液后放回緩釋裝置中。采用ELISA法測定NGF質量濃度，計算每次取樣時釋放的NGF總量，并繪制微球累積釋放曲線。

1.2.3 可注射NGF緩釋制劑包裹NGF的生物活性的測定 釋放第1、10、28、49天的NGF被用來檢測體外NGF活性。PC12細胞能在NGF的刺激下發(fā)出突起分化為神經元樣細胞，因此可通過計算陽性PC12細胞的比例來考察NGF的活性。將生長良好的PC12細胞接種于預先經鼠尾膠原包被的6孔培養(yǎng)板中，接種密度為2×104/cm2，每孔加入2m L含體積分數(shù)為10%馬血清和體積分數(shù)為5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、體積分數(shù)為5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)3 h后隨機分組，分為NGF組（陽性對照組）、不含NGF的牛血清白蛋白微球緩釋制劑組（陰性對照組）和可注射NGF緩釋制劑組（實驗組），分別以50 pg/L的NGF、牛血清白蛋白微球的緩釋液、可注射NGF緩釋制劑2m L替換原細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，在倒置顯微鏡隨機選取視野，計數(shù)100個細胞，并計算每組中細胞最長突起長度大于胞體直徑的細胞（即陽性細胞）的比例，陽性細胞比例（%）＝陽性細胞數(shù)/計數(shù)細胞數(shù)×100%，每組實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量結果以（x±s）表示，t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 可注射NGF緩釋制劑

NGF微球肉眼觀察制備的微囊呈白色疏松粉末。電鏡下見微球表面光滑，分散好，彼此間無粘連，粒徑大小30～40μm，見圖1。利用生物纖維蛋白膠混合前呈液態(tài)特性，將NGF微球加入抑胰肽酶溶液中，與凝血酶溶液混合10 s后，發(fā)生凝固，3～5m in后更明顯，見圖2。

圖1 掃描電鏡觀察NGF微球表面特征

圖2 可注射NGF緩釋制劑凝固后形態(tài)(×40）

2.2 可注射NGF緩釋制劑體外釋放NGF測定結果

可注射NGF緩釋制劑可持續(xù)釋放NGF達49 d。6 h取樣，NGF微球可釋放包裹NGF總量15%，可注射NGF緩釋制劑為5%；前3 d取樣，NGF微球累積釋放量為21%，可注射NGF緩釋制劑為8%，從體外NGF釋放曲線來看，可注射NGF緩釋制劑可以明顯減少藥物突釋，使藥物釋放更加平穩(wěn)，見圖3。

2.3 可注射NGF緩釋制劑包裹NGF的生物活性測定結果

至第49天時，實驗組可注射NGF緩釋制劑活性下降不明顯，與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，明顯大于陰性對照組，有顯著性差異（P＜0.01），見圖 4、表 1。

表1 3組陽性PC12細胞比例比較（%，x±s）

圖4 陽性對照組（A）、陰性對照組（B）、實驗組（C）陽性 PC12細胞（×200）

3 討論

本研究在體外試驗中，NGF復合緩釋制劑與DRG共培養(yǎng)時，DRG的神經再生纖維朝NGF復合緩釋制劑方向生長密集，這與復合緩釋制劑中釋放的NGF形成濃度梯度有關。神經損傷后，再生的軸突需要相當長的時間才能生長達到周圍靶器官，在靶器官重獲神經支配前，肌肉可能已經發(fā)生不可逆轉的萎縮。而加快神經再生速度是完全恢復神經損傷功能的前提條件，防止其靶器官失神經萎縮。在動物體內實驗，本研究應用保留基底膜等結構的化學去細胞異體神經修復神經缺損時，復合緩釋制劑緩釋的活性NGF可明顯提高神經軸突再生的速度。

本研究采用生物纖維蛋白膠與NGF的聚乳羥基乙酸共聚物（poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA）微球混合制成NGF復合緩釋制劑。纖維蛋白膠是一種可以在體內降解的生物材料，現(xiàn)已有多種生長因子以纖維蛋白膠為載體進行緩釋，Bhang等[7]以纖維蛋白膠作為NGF載體，體外持續(xù)釋放具有生物活性NGF達14 d，局部應用方便，但纖維蛋白膠在體內降解速度比較快，影響生長因子長時間發(fā)揮其生物活性。NGF的PLGA微球具有無毒、可生物降解和生物相溶性好等特征，它最大的優(yōu)勢是其降解時間可受分子量和聚合物含量比例的調節(jié)，是一種較為理想的載體材料。Camarata等[8]研制了NGF的PLGA微球，它具有明顯的緩釋性質，體外釋藥研究檢測到微球可持續(xù)釋放NGF 5周以上，釋出的NGF具有較強的生物學活性。但微球存在釋藥初期突釋現(xiàn)象，造成NGF微球突釋主要原因是：微球制備過程部分NGF蛋白分子存在于微球表面，或者內部存在孔洞，故而在釋放初期，NGF可直接或通過孔洞迅速釋放，形成突釋。本研究將NGF微球與纖維蛋白膠混合形成復合體，從體外藥物緩釋實驗可證實6 h NGF微球釋放從15%降至5%，前3 d從釋放30%降至15%左右，生物纖維蛋白膠與NGF微球混合后，可減少NGF微球突釋情況，使NGF更平穩(wěn)發(fā)揮其生物活性，并在體內應用更方便，是一種理想的NGF緩釋載體。

[1]Huang J,Xiang J,Yan Q,etal.Dog Tibial Nerve Regeneration across a 30-mm Defect Bridged by a PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF Sustained-Release Conduit[J].JReconstrmicrosurg,2012,29:77-87.

[2]Xu H,Yan Y,Li S.PDLLA/chondroitin sulfate/chitosan/NGF conduits for peripheral nerve regeneration[J].Biomaterials,2011,32:4506-4516.

[3]Sun H,Xu F,Guo D,et al.Preparation and evaluation of NGF-microsphere conduits for regeneration of defective nerves[J].Neurol Res,2012,34:491-497.

[4]Gravvanis AI,Tsoutsos DA,Tagaris GA,et al.Beneficial effect of nerve growth factor-7S on peripheral nerve regeneration through inside-out vein grafts:An experimentalstudy[J].microsurgery,2004,24:408-415.

[5]TsaiCC,Lu MC,Chen YS,etal.Locally adm inistered nerve growth factor suppresses ginsenoside Rb1-enhanced peripheralnerve regeneration[J].Am J Chin Med,2003,31:665-673.

[6]Xu X,Yu H,Gao S,etal.Polyphosphoestermicroshperes for sustained release of biologically active nerve growth factor [J].Biomaterials,2002,23:3765-3722.

[7]Bhang SH,Jeon O,ChoiCY,etal.Controlled release of Nerve growth factor from fibrin gel[J].J Biomed MaterResA,2007,80:998-1002.

[8]Camarata PJ,Suryanarayanan R,TurnerDA,etal.Sustained nerve growth factor from biodegradable polymer microsphere[J].Neurosurgery,1992,30:313-319.

Preparation and Property of In jected Controlled Release of Nerve Growth Factor

YU Hai-long,XIANG Liang-bi,ZHOU Da-peng,TIAN Jing,BI Yan.Department of Orthopedics,General Hospital of Shenyang M ilitary Area Command ofChinese PLA,Shenyang 110840,China

Objective:To observe the general properties and drug release characteristics of the injected controlled release drug vehiclesof nerve growth factor(NGF)in vitro.Methods:Themicrospheresof NGFwere prepared by drugmicrosphere technology and fixed with fibrin gels tomake the injected controlled release drug of NGF.The NGF released from microsphereswas evaluated by ELISA quantitative determ ination and PC12 cells neurite outgrowth assay.Results:NGFwas detectable from the complicated controlled release drug of NGF forat least7 weeks and the released NGF could stimulate the neuritis growth of PC12 cells.Conclusion:The complicated controlled release drug of NGF can release NGF for long time and maintain the bioactivity of NGF.The drugmay be used asexogenous NGF to improve the regeneration ofnerve.

nerve growth factor;tissueadhesive;PC12 cells

R741;R622.3

A

1001-117X(2013)06-0404-03

DOI10.3870/sjsscj.2013.06.004

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院骨科沈陽110840

全軍醫(yī)學科學技術研究“十二五”課題（No.CWS11J209）；遼寧省科技計劃項目（No.2012225019）

2012-12 -06

于海龍

yuhailong118@aliyun.com