縫隙連接蛋白43在胃癌中表達(dá)的意義

劉海旺，李春輝△，李建玲

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.病理科；2.麻醉科，河北承德 067000）

胃癌是我國常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在我國各類腫瘤中居首位，但胃癌的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，因此胃癌發(fā)病機(jī)制的研究就成為了目前的研究重點(diǎn)?？p隙連接是相鄰細(xì)胞間的膜通道結(jié)構(gòu)，由胞膜上的縫隙連接蛋白（con-nexin，Cx）構(gòu)成，其中包括Cx43，細(xì)胞通過它所介導(dǎo)的細(xì)胞縫隙連接通訊（gap junction intercellular communication，GJIC）進(jìn)行細(xì)胞間信息和能量的傳遞，調(diào)控細(xì)胞的生長、分化和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。而在胃腫瘤細(xì)胞中存在Cx的異常表達(dá)，可能使得腫瘤細(xì)胞生長速度加快，增值能力增強(qiáng)，與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移也有密切的聯(lián)系。本研究通過免疫組織化學(xué)染色方法觀察Cx43在胃癌組織和正常胃組織中的表達(dá)情況，并通過分析其表達(dá)方式與臨床病理特征的關(guān)系，進(jìn)一步探討胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2010年9月至2012年2月手術(shù)切除經(jīng)病理證實(shí)為胃癌組織60例及正常胃組織25例，常規(guī)取材固定于中性甲醛液后，逐級脫水石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)法染色。60例胃癌患者中，男48例，女12例；年齡45～77歲，平均（58.5±10.0）歲。高、中分化者24例，低分化者36例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例；Ⅰ＋Ⅱ期28例，Ⅲ＋Ⅳ期32例。25例正常胃組織來自本院健康體檢者，其中男16例，女9例；年齡46～72歲，平均（60.0±6.0）歲。

1.2 試劑與儀器 一抗兔抗人多克隆Cx43抗體（ZA-0444）購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，抗體稀釋倍數(shù)為1∶100，二抗為快捷型酶標(biāo)羊抗鼠／兔IgG聚合物，DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司（DAB-0031），二甲苯、乙醇、3%H2O2、枸櫞酸鈉等常規(guī)試劑購自北京化學(xué)試劑公司。全自動(dòng)脫水機(jī)（英國Shandon Thrmo公司），S325石蠟切片機(jī)（英國Shandon公司產(chǎn)品），G2X-DH-40X45電熱恒溫箱（山東立鶴公司產(chǎn)品），BX40F4顯微鏡（日本 Olympus公司產(chǎn)品），顯微照相系統(tǒng)（日本Olympus公司產(chǎn)品）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)方法 標(biāo)本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后連續(xù)切片4μm，切片以二甲苯脫蠟及系列乙醇脫水；磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗5min，以3%H2O2孵育10min（室溫）；PBS沖洗2×6min后在微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)；加Cx43抗體，在37℃濕盒中溫育60min后，在濕盒中4℃過夜；PBS洗3×5min，滴加二抗，室溫孵育15min；PBS洗3×5min，DAB顯色5 min，蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染核；封片，觀察。另外，組織切片用PBS替代Cx43抗體（其余染色步驟相同）作為陰性對照，用已知正常胃組織的陽性切片作為陽性對照。

1.3.2 免疫組化結(jié)果判定方法 正常胃組織中Cx43陽性信號主要表達(dá)于細(xì)胞膜，在胃癌組織中可表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。在染色均勻的區(qū)域，選取5個(gè)高倍鏡視野（×400）：（1）按陽性細(xì)胞百分率（A值）評分：1%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%為3分；（2）按染色強(qiáng)度（B值）評分：不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。綜合A值與B值判斷結(jié)果，陰性（-）為0分，弱陽性（＋）為1～2分，中度陽性（＋＋）為3～4分，強(qiáng)陽性（＋＋＋）為5～6分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件完成，計(jì)數(shù)資料采用四格表χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Cx43在正常胃組織和胃癌組織中的表達(dá) 正常胃組織中Cx43的陽性表達(dá)率為100%（25／25），明顯高于胃癌組織陽性表達(dá)率66.7%（40／60），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 胃癌組織中Cx43的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

圖1 高、中分化胃癌Cx43的表達(dá)（×100）

圖2 低分化胃癌Cx43的表達(dá)（×100）

2.2 胃癌組織中Cx43的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 高、中分化者Cx43的陽性表達(dá)率為83.3%（20／24）高于低分化者的陽性表達(dá)率55.6%（20／36），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Cx43的陽表達(dá)率為88.0%（22／25）高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的陽性表達(dá)率51.4%（18／35），Ⅰ＋Ⅱ期 Cx43的陽性表達(dá)率為89.3%（25／28）高于 Ⅲ＋Ⅳ期的陽性表達(dá)率46.9%（15／32），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1，圖1、2。

3 討 論

縫隙連接是相鄰細(xì)胞間的膜通道結(jié)構(gòu)，由胞膜上的Cx構(gòu)成，細(xì)胞通過它所介導(dǎo)的GJIC進(jìn)行細(xì)胞間信息和能量的傳遞，調(diào)控細(xì)胞的生長、分化和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，對機(jī)體功能的維持發(fā)揮重要作用，胃癌的發(fā)生可能與 GJIC功能異常有關(guān)［1-2］。Cx43被認(rèn)為是胃黏膜中的主要連接蛋白，連接蛋白的共同結(jié)構(gòu)由4個(gè)跨膜親水片段M1-4，為α螺旋結(jié)構(gòu)，2個(gè)胞外環(huán)E1-2和1個(gè)胞質(zhì)環(huán)，縫隙連接是通訊連接的主要形式，是溝通相鄰細(xì)胞的跨膜通道［3-4］。一些離子和相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì)可以直接從一個(gè)細(xì)胞流入另一個(gè)細(xì)胞內(nèi)，這樣周圍的健康細(xì)胞便可以營養(yǎng)相鄰的病態(tài)細(xì)胞［5］?？p隙連接的功能除介導(dǎo)細(xì)胞之間的連接外，主要是偶聯(lián)細(xì)胞間通訊，包括電偶聯(lián)和化學(xué)偶聯(lián)［6］，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的縫隙連接通訊功能微弱或缺失，細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后其GJIC功能降低或抑制，被認(rèn)為是促癌變階段的重要機(jī)制，Cx43主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，當(dāng)其表達(dá)異常，如表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)時(shí)可能已經(jīng)發(fā)生了癌變［7］。Tang等［8］研究發(fā)現(xiàn)在胃腫瘤細(xì)胞中與鄰近的正常細(xì)胞相比Cx43顯著性的低表達(dá)，在有轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中與胃腫瘤細(xì)胞相比Cx43顯著性的高表達(dá)，同時(shí)提出Cx43的低表達(dá)可能促成了胃癌的發(fā)生。但Cx43的高表達(dá)也可能促成了胃癌細(xì)胞高效的新陳代謝以至于發(fā)展到有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［9-11］。研究也發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮間可有明顯的陽性著色，這表明腫瘤細(xì)胞可能利用間隙連接從血管中獲取營養(yǎng)物質(zhì)［12］。Cx43表達(dá)量的變化還可能與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，Su等［13］應(yīng)用Cx43轉(zhuǎn)染惡性黑色素瘤細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的Cx43表達(dá)增強(qiáng)，貼壁依賴性生長受到了抑制，Cx43基因可上調(diào)腫瘤細(xì)胞Cx43mRNA的表達(dá)，促進(jìn)磷酸化，恢復(fù)和增強(qiáng)GJIC功能，逆轉(zhuǎn)惡性表型，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。同時(shí)也有研究認(rèn)為縫隙連接的表達(dá)是腫瘤細(xì)胞浸潤的條件之一［14］。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)法對Cx43在正常胃黏膜及胃癌組織中的表達(dá)進(jìn)行研究，研究發(fā)現(xiàn)Cx43在正常胃黏膜中的表達(dá)明顯高于其在胃癌組織中的表達(dá)，高、中分化胃癌Cx43的表達(dá)均高于低分化胃癌組；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌Cx43的表達(dá)高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組，胃癌組織Ⅰ＋Ⅱ期Cx43的表達(dá)高于 Ⅲ＋Ⅳ期的表達(dá)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前的某些研究結(jié)果一致［15］，進(jìn)一步驗(yàn)證了縫隙連接的異常表達(dá)與腫瘤的浸潤性生長能力較強(qiáng)有關(guān)。

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