抗真菌藥對復發(fā)急性弓形蟲病小鼠的保護研究

吳升偉，胡國順，王正蓉，包懷恩

弓形蟲感染對免疫功能缺陷或使用免疫抑制劑的患者可造成巨大危害［1］，是免疫缺損者發(fā)生機會性感染的主要病原之一，患者可出現(xiàn)腦炎、肺炎及心肌炎，以及播散性弓形蟲病，甚至死亡。同時資料顯示，臨床上免疫功能低下宿主的弓形蟲病大多系原已潛伏的隱性感染的復發(fā)而非初發(fā)［2］。因此，研究復發(fā)性弓形蟲病并進行治療干預具有重要意義。

弓形蟲腦炎是弓形蟲感染的最嚴重的后果，在免疫功能低下，例如艾滋病患者較常見，而這些患者通常伴有機會性真菌感染［3］。如果抗真菌藥對弓形蟲病治療有效，這不僅將減輕患者的經(jīng)濟負擔，又利于防止過多藥物副反應(yīng)的發(fā)生。

目前國內(nèi)外尚未見用抗真菌藥對隱性弓形蟲感染宿主誘導復發(fā)成急性弓形蟲病的保護研究。本研究中，我們使用三唑類抗真菌藥物－氟康唑或伊曲康唑治療隱性弓形蟲感染的復發(fā)，探討其對小鼠存活率及腦組織內(nèi)包囊數(shù)的影響，并與常用的抗弓形蟲藥物阿奇霉素比較以明確療效，希望為患者提供一種備選的治療方案。

1 材料和方法

1．1 實驗動物6～8周齡SPF級ICR雌性小鼠，體重20～25g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；小鼠許可證編號SCXK（京）2006－0009）。

1．2 蟲株 弓形蟲PRU株由蚌埠醫(yī)學院孫新教授和南京醫(yī)科大學陳錫慰教授惠贈，本室在昆明小鼠體內(nèi)傳代保種。

1．3 主要試劑 阿奇霉素分散片（珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司中山分公司，產(chǎn)品批號：00902701）；氟康唑膠囊（山東綠因藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號：100101）；伊曲康唑膠囊（西安揚森制藥有限公司，產(chǎn)品批號：101026983）；注射用環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，產(chǎn)品批號：11060421）。以上藥物均在有效期內(nèi)使用。

1．4 小鼠的感染、實驗分組、標本采集及處理 90只ICR雌性小鼠分為感染組（80只）和對照組（10只），感染組小鼠經(jīng)腹腔注射弓形蟲PRU株10個包囊／只鼠（于試管內(nèi)用無菌PBS調(diào)整至0．5mL），觀察感染小鼠發(fā)病情況，急性期死亡小鼠焚燒處理。2個月后，將感染小鼠進行分組：環(huán)磷酰胺組（CTX，n＝11只）；環(huán)磷酰胺＋氟康唑組（CTX＋F），此組又按氟康唑濃度不同分為3組，即F（20mg／kg·d，n＝7只），F(xiàn)（30mg／kg·d，n＝7只）和F（40mg／kg·d，n＝7只）；環(huán)磷酰胺＋伊曲康唑組（CTX＋I），此組也按伊曲康唑濃度不同分為3組，即I（20mg／kg·d，n＝6只），I（30mg／kg·d，n＝6只）和I（40 mg／kg·d，n＝7只）；環(huán)磷酰胺＋阿奇霉素組（CTX＋A，n＝7只），阿奇霉素濃度為250mg／kg·d。實驗中阿奇霉素的藥物劑量參照文獻［4］，三唑類藥物劑量參照文獻［5－6］，并進行調(diào)整。除外，還設(shè)置正常小鼠＋環(huán)磷酰胺（N＋CTX，n＝8只）和感染組（In，n＝7只）作對照。除In組小鼠外，各組小鼠每天腹腔注射環(huán)磷酰胺（100mg／kg·d），同時CTX＋F、CTX＋I和CTX＋A組小鼠用灌胃方法分別喂食不同濃度的氟康唑、伊曲康唑和阿奇霉素，連續(xù)用藥14d。

實驗組和對照組小鼠觀察給藥后發(fā)病及死亡情況，解剖死亡小鼠，取其腦組織，按0．5g腦組織中加入1mL PBS進行充分勻漿，取10μL勻漿液于載玻片上壓片鏡檢，計數(shù)弓形蟲包囊數(shù)量，共進行3次檢測，其平均數(shù)×100即為整個小鼠腦組織的包囊數(shù)。實驗結(jié)束時存活小鼠用頸椎脫臼方法處死，按前述方法處理后進行腦組織包囊計數(shù)。

1．5 統(tǒng)計分析 使用統(tǒng)計分析軟件SPSS 11．5對各組小鼠腦組織包囊數(shù)據(jù)進行t檢驗，對生存時間進行Mann－Whitney檢驗。

2 結(jié) 果

2．1 臨床表現(xiàn) CTX組小鼠從用藥第8d開始逐漸出現(xiàn)聳毛、怠惰、抖動、食欲下降及腹瀉等臨床表現(xiàn)，與小鼠感染弓形蟲PRU株后的急性期表現(xiàn)一致［7］。

2．2 三唑類藥物對復發(fā)小鼠存活率的影響 實驗開始以前，5只未感染ICR小鼠被用高于最高劑量2倍的氟康唑或伊曲康唑溶液灌胃，連續(xù)用藥14d，其間觀察小鼠有無食欲減退、體重減輕、聳毛和死亡等癥狀，確定40mg／kg·d的伊曲康唑或氟康唑?qū)π∈鬅o毒性。此外，20只感染弓形蟲PRU株包囊2個月的ICR小鼠被分組進行環(huán)磷酰胺藥物劑量確定實驗。每組小鼠5只，腹腔注射環(huán)磷酰胺的劑量分別為50mg／kg·d，75mg／kg·d，100mg／kg·d及125mg／kg·d，連續(xù)用藥14d，其間觀察小鼠有無食欲減退、體重減輕、聳毛和死亡等癥狀，并計數(shù)腦組織內(nèi)包囊數(shù)量，最后綜合評價，確定實驗中使用的環(huán)磷酰胺濃度為100mg／kg·d。

實驗結(jié)束時（即用藥14d時），CTX組小鼠全部死亡，存活率為0，CTX＋A組、N＋CTX組及In組小鼠全部存活，CTX＋A組與CTX組存活率差異有統(tǒng)計學意義（P＝0．016），使所有的小鼠免于死亡。氟康唑F（20mg）、F（30mg）和F（40mg）組的存活率是相同的，均為71%；伊曲康唑I（20mg）、I（30mg）和I（40mg）組的存活率分別為17%，50%和29%，氟康唑?qū)φT導復發(fā)急性弓形蟲病的小鼠的保護明顯強于伊曲康唑（P＝0．000），但是由藥物劑量不同所導致的各自的存活率是沒有區(qū)別的。CTX組、F組、I組和A組對復發(fā)急性弓形蟲病小鼠的存活情況差異有統(tǒng)計學意義（P＝0．000），伊曲康唑和氟康唑?qū)桶l(fā)急性弓形蟲病小鼠產(chǎn)生的保護作用是低于阿奇霉素（P值分別為0．000和0．001）（圖1）。

圖1 各組感染小鼠生存情況Fig．1 Survival situation in different infected mice groupsA：CTX－P＝0．016；I：CTX－P＝0．042；I：F－P＝0．000；A：F－P＝0．001；A：I－P＝0．000；CTX：F：I：A－P＝0．000

2．3 三唑類藥物對復發(fā)誘導小鼠腦組織內(nèi)包囊數(shù)的影響 將實驗過程中死亡小鼠及實驗結(jié)束后存活小鼠用頸椎脫臼方法處死，剖解小鼠，取出腦組織，PBS充分勻漿后，取10μL腦組織勻漿液壓片鏡檢，計數(shù)包囊數(shù)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTX組與In組、F組、I組和A組比較，小鼠腦組織包囊數(shù)量明顯增加了（F＝3．985，P＝0．001），但是A、I、F和In之間的包囊數(shù)差別是無統(tǒng)計學意義的。說明使用環(huán)磷酰胺后導致小鼠腦組織內(nèi)包囊數(shù)急劇增加。盡管F組和I組三個濃度之間包囊數(shù)是不同的，但是它們均無統(tǒng)計學差異（F組方差分析結(jié)果：F＝0．605，P＝0．561；I組方差分析結(jié)果：F＝0．034，P＝0．967）。參見圖2。

圖2 感染各組小鼠腦組織包囊數(shù)Fig．2 The number of cysts in the brain from different infected mice groups＊：Significant deviation on the number of cysts between the In group and others，P＜0．05．

3 討 論

目前用于弓形蟲病治療的藥物主要有磺胺類藥物和阿奇霉素等抗生素，同時許多化學性藥物及中藥等均對弓形蟲病有一定的治療作用，但均未找到一種毒副作用小、能完全根除弓形蟲的藥物。因此，尋找新的替代療法，已經(jīng)成為臨床急需解決的問題。

近年來國外對抗真菌藥治療弓形蟲病開展了研究。Sonda S等［8－9］對抗真菌藥金擔子素 A 的體外抗弓形蟲活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)其能夠阻礙弓形蟲的復制，且對哺乳動物細胞的新陳代謝無影響。E′rica dos等［5－6］觀察了三唑類抗真菌藥物抗急性弓形蟲病的效果，發(fā)現(xiàn)它們能提高小鼠存活率，降低腦組織包囊負擔。

本研究在對誘導復發(fā)的急性弓形蟲病小鼠進行存活率觀察時，發(fā)現(xiàn)CTX組、F組、I組及A組小鼠的存活情況差異顯著。3種藥物中阿奇霉素效果最好，氟康唑效果又較伊曲康唑明顯。這與E′rica dos S．M．D等在急性弓形蟲病小鼠模型上觀察的結(jié)果一致。在對包囊進行計數(shù)時，發(fā)現(xiàn)CTX組小鼠包囊數(shù)明顯高于其余實驗組，可能原因為細胞毒性藥物的使用，降低了宿主的抵抗力，促使形成大量的弓形蟲包囊。CTX組與F組、I組及A組包囊數(shù)量是不一樣的，說明這3種藥物對弓形蟲包囊的產(chǎn)生均有一定的抑制作用，但是均不能完全消除弓形蟲包囊，可能因為大劑量的細胞毒性藥物的使用，使?jié)摲谒拗鹘M織中的包囊破裂，緩殖子出來，同時也不斷的產(chǎn)生新的弓形蟲包囊，包囊有著完整的囊壁，其內(nèi)緩殖子代謝降低，故藥物的作用力度就?。煌瑫r由于腦組織的特殊結(jié)構(gòu)，導致大部分藥物很難進入。實驗中發(fā)現(xiàn)伊曲康唑組包囊數(shù)是低于氟康唑組的，但是兩者無統(tǒng)計學意義，這與 E′rica dos S．M．D等的發(fā)現(xiàn)是有一定區(qū)別的：后者發(fā)現(xiàn)伊曲康唑能降低急性弓形蟲病小鼠腦組織中的包囊負擔，考慮原因為與所用的動物模型及每組的實驗動物數(shù)量有很大的關(guān)系。

氟康唑和伊曲康唑均屬于三唑類廣譜抗真菌藥，其藥物代謝動力學和低毒性是眾所周知的。三唑類藥物抗真菌的作用機制是干擾真菌細胞膜麥角固醇的生物合成，并對真菌細胞色素P450酶系統(tǒng)有較強的選擇性，親和力強，但是對人類細胞色素P450酶系統(tǒng)親和力差，故毒性較低，且對內(nèi)分泌沒有影響。現(xiàn)有的試驗表明它們對新型隱球菌和念珠菌屬等有抑菌活性，并對它們引起的全身性感染和顱內(nèi)感染有效。但是三唑類藥物抗弓形蟲的作用機制暫時是不清楚的，這將是下一步研究的重點。

盡管阿奇霉素對弓形蟲病復發(fā)的治療效果最好，但是臨床上免疫抑制病人并發(fā)弓形蟲感染同時往往伴有隱球菌或念珠菌等機會性真菌感染，而對這類病人抗真菌藥有阿奇霉素不具備的優(yōu)點，能夠使用一種藥物同時治療兩種疾病，這既可以減輕藥物副反應(yīng)的發(fā)生，又可以降低病人的經(jīng)濟負擔。因此，氟康唑可以考慮作為一種潛在的抗弓形蟲的藥物。

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