干擾日本血吸蟲凋亡抑制因子最佳siRNA分子的篩選

羅 榮，趙江平，胡 超，程國鋒

日本血吸蟲病為人獸共患寄生蟲病，危害嚴重，是我國最重要的公共衛(wèi)生問題之一。雖然半個多世紀來，我國血吸蟲病防治取得了重大成就，但防治形勢仍然很嚴峻[1－2]。

盡管血吸蟲面對宿主的免疫排斥和對抗，仍可在終末宿主體內(nèi)存活數(shù)年，推測蟲體細胞生死存活調(diào)控可能具有一定的特殊性[3－4]。凋亡作為細胞內(nèi)程序性的有序死亡，是生命體維持自身生長發(fā)育、病理及生理性反應的重要方式。凋亡抑制因子作為細胞凋亡調(diào)控的負因子，已引起了有關(guān)學者的關(guān)注。在日本血吸蟲中，已有凋亡負調(diào)控相關(guān)的因子SjBcl－2／1、SjBcl－2／2、SjA[3]、SjIAP[4]和Sj－CIAP[5]等研究報道。我們實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲凋亡抑制因子可顯著抑制人HEK293T的凋亡[4]，提示SjIAP在日本血吸蟲的寄生和生長發(fā)育中可能發(fā)揮重要作用。

為進一步研究SjIAP的功能，本研究根據(jù)其cDNA序列設計了3對siRNA分子，首先在HEK293T細胞中篩選出了最佳siRNA干擾分子，然后利用獲得最佳的siRNA分子對體外培養(yǎng)的日本血吸蟲蟲體進行干擾研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和生物材料 新西蘭大耳兔購自上海羅涇飛達實驗動物養(yǎng)殖場；BALB／c小鼠購自中國科學院上海實驗動物中心。日本血吸蟲尾蚴由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供。利用腹部貼片法將尾蚴感染新西蘭白兔（約3 000條尾蚴／兔）以及BALB／c小鼠（約150條尾蚴／鼠），感染后第12d剖殺動物，肝門靜脈灌注法收集血吸蟲蟲體，然后立即進行體外培養(yǎng)。培養(yǎng)基組成為：RPMI－1640中加入終濃度10% 胎牛血清（V／V）、100 U／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素、0.2%D－葡萄糖（g／V）、0.1% 水解乳蛋白 （g／V）、1μmol／L次黃嘌呤、1μmol／L 5－羥色胺、0.5μmol／L氫化可的松和0.2U／mL胰島素。培養(yǎng)條件：37。C、CO2濃度為5%的細胞培養(yǎng)箱。

1.2 試劑耗材 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（青霉素和鏈霉素）購自上海世儀生物有限公司；Lipofectamine 2000和Opti－MEM?培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；Caspase3／7檢測試劑盒購自Promega公司；抗Tubulin抗體和羊抗兔的IgG－HRP購自北京康為世紀有限公司；氫化可的松、5－羥色胺、次黃嘌呤和胰島素購自Sigma公司；Bradford蛋白定量試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；小干擾siRNA分子由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設計并化學合成。

1.3 HEK293T細胞培養(yǎng) HEK293T細胞由本實驗室惠存，培養(yǎng)液為95%DMEM培養(yǎng)基、5% 胎牛血清、100U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素；培養(yǎng)條件：37。C、5%CO2細胞培養(yǎng)箱。待細胞培養(yǎng)匯合約90%時，利用胰酶消化細胞，消化結(jié)束后加入胎牛血清終止反應，將消化的細胞離心并洗滌，加入培養(yǎng)基，在新培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)。

1.4 質(zhì)粒和SiRNA共轉(zhuǎn)染 首先將A液（50μL Opti－MEM ＋1.5μL Lipofectamine 2000）充分混勻且室溫孵育5min，然后將其轉(zhuǎn)移至B液（50μL Opti－MEM ＋400ng pcDNA3.1（＋）－IAP＋2μL siRNA）中，充分混勻后室溫繼續(xù)孵育20min，然后小心將其加入細胞培養(yǎng)孔中且搖勻，繼續(xù)進行培養(yǎng)，48h后收集轉(zhuǎn)染細胞，分別利用Real time RT－PCR檢測IAP的轉(zhuǎn)錄水平和免疫印跡檢測IAP蛋白水平變化。

1.5 日本血吸蟲體外RNA干擾 將收集的日本血吸蟲蟲體用0.5%（w／v）的水解乳蛋白溶液洗滌3次，添加完全培養(yǎng)基于12孔培養(yǎng)板進行體外培養(yǎng)，每孔培養(yǎng)基為3mL，蟲體約為25條。實驗共設：空白組，無關(guān)對照組，siRNA－592和siRNA－951處理組，RNA終濃度均為100nmol／L，培養(yǎng)條件如前所述，每12h補加一次RNA。培養(yǎng)72h后，收集蟲體進行IAP轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測。

1.6 Real time RT－PCR 利用Trizol提取轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞或日本血吸蟲蟲體總RNA。將1 μg細胞或蟲體總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，將1μL cDNA作為模版，進行Real time RT－PCR檢測IAP轉(zhuǎn)錄水平的變化。反應體系為：細胞或蟲體cDNA 1μL，2×SBYR?Primix Ex TaqTMⅡ7.5 μL，引物0.3μL（SjIAP上游：5′－CGG ATC AAC CTG AAG CGT GT－3′，下游：5′－ATT ACC CCA GGA AGA CCA CG－3’），dH2O 6.2μL。PCR運行參數(shù)是：95。C，30s；循環(huán)擴增反應為：95。C，5s；60。C，34s，共40個循環(huán)。分別以人18S核糖體RNA（上游：5′－GAC GGA AGG GCA CCA CCA G－3′ 下 游：5′－ACC AGA CAA ATC GCT CCA CC－3′）和血吸蟲煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（上游：5′－CGA GGA CCT AAC AGC AGA GG－3′下游：5′–TCC GAA CGA ACT TTG AAT TC－3′）為內(nèi)參，通過2－ΔΔCt方法計算IAP的相對表達量。

1.7 免疫印跡分析 利用Bradford法（生工生物工程（上海）股份有限公司）對HEK293T細胞和日本血吸蟲蟲體蛋白進行定量，將20μg蛋白樣品進行電泳（10%SDS－聚丙稀酰胺凝膠）分離，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜（Whatman Germany）上。膜在5%（W／V）脫脂奶粉封閉2h，結(jié)束后，利用PBST（pH＝7.4）對膜進行洗滌。然后，分別將抗IAP抗體（稀釋度為1∶500）和抗Tubulin的抗體與膜共溫育1h，結(jié)束后，用PBST（pH＝7.4）溶液洗3次，每次5min。利用羊抗兔（鼠）IgG－HRP作為二抗，室溫下與硝酸纖維膜孵育30min，然后再用PBST溶液洗3次，每次5min。最后，利用ECL反應液進行顯色。

1.8 Caspase3／7活性檢測 利用 Caspase 3／7as－say試劑盒進行Caspase 3／7活性測定，將80μL的蟲體裂解液與80μL Caspase試劑混合。然后，在室溫作用30min。結(jié)束后，取100μL的混合物在熒光酶檢測儀（Berthold FB 12Luminometer）進行測定。同時，利用Bradford法進行蛋白定量，通過蛋白濃度對熒光值進行均一化處理。數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析采用T檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 干擾SjIAP的最佳siRNA分子篩選 利用生物信息學，根據(jù)SjIAP的cDNA序列設計3對siRNA分子（表1），對其進行化學合成。將體外退火的每對siRNA分子分別與重組質(zhì)粒pcDNA3.1（＋）－IAP共轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中。利用Real time RT－PCR分析IAP轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染siRNA－592和siRNA－951小RNA分子可顯著降低SjIAP的轉(zhuǎn)錄，其中siRNA－951抑制能力最強，可達79%（圖1）。

表1 日本血吸蟲IAP的siRNAs序列Tab.1 List of the siRNAs used for SjIAP silence

圖1 實時定量RT－PCR分析最佳干擾IAP的siRNA分子Fig.1 Real－time RT－PCR analysis of the siRNAs for silencing IAP in HEK293Tcell

2.2 最佳siRNA的蟲體內(nèi)干擾研究 在體外培養(yǎng)的日本血吸蟲童蟲（12d）中分別加入siRNA－951，siRNA－592及無關(guān)對照siRNA（終濃度均為100 nmol／L），繼續(xù)培養(yǎng)72h，收集蟲體，檢測SjIAP轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達情況。結(jié)果表明實時RTPCR顯示干擾72h后蟲體SjIAP的轉(zhuǎn)錄水平均沒有明顯變化（圖2）。進一步免疫印跡分析表明siRNA－951處理組可顯著降低蟲體內(nèi)SjIAP的表達（圖3）。

圖2 實時定量RT－PCR分析最佳干擾siRNA分子干擾血吸蟲體內(nèi)IAP的效果Fig.2 Real－time RT－PCR analysis of the siRNAs for silencing IAP in S.japonicum

圖3 免疫印跡分析血吸蟲IAP干擾的效果Fig.3 Western blot analysis of the IAP expression in schistosomes treated by the siRNAs

2.3SjIAP敲降后蟲體Caspase活性測定 本課題組前期研究表明SjIAP可抑制人HEK293細胞凋亡的進程，Caspase作為細胞凋亡過程中重要活性分子，對此測定可反映細胞凋亡的強弱[4－5]。為此，在siRNA處理72h后，對蟲體內(nèi)的Caspase3／7活性檢測。結(jié)果表明，與空白對照組和無關(guān)對照組相比，siRNA－951 和 siRNA－592 處 理 組 蟲 體 的Caspase3／7活性有所提高（圖4），提示干擾SjIAP后血吸蟲蟲體細胞的凋亡可能有所上升。另外，siRNA處理和對照組的蟲體形態(tài)沒有明顯區(qū)別。

圖4 日本血吸蟲IAP干擾后Caspase 3／7活性分析Fig.4 Effect of SjIAP silence in schistosomes on Caspase 3／7 activity

3 討 論

研究表明寄生蟲可調(diào)控宿主細胞的凋亡以維持其寄生[6－7]。日本血吸蟲成蟲通常寄生于終末宿主的腸系膜靜脈內(nèi)，雖然直接面對來自宿主血液體統(tǒng)的免疫排斥和對抗，仍能存活長達數(shù)年。因此，深入研究血吸蟲如何調(diào)控自身細胞的存活的分子機理并對其進行干預有可能開拓血吸蟲病防控的新途徑。血吸蟲基因組學研究表明蟲體內(nèi)存在編碼與高等動物類似細胞凋亡信號通路。我們課題組前期研究表明血吸蟲IAP蛋白能顯著抑制放線菌素誘導的HEK293T細胞的凋亡[4]。為進一步研究此分子的功能，本研究根據(jù)SjIAP的cDNA序列設計了3對siRNA分子。分別將3對siRNA分子與表達SjIAP的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中，實時定量RT－PCR和免疫印跡分析表明獲得了2個干擾效果較好的siRNA分子（siRNA－592和siRNA－951）。然后，將這2個siRNA分子分別加入到干擾體外培養(yǎng)日本血吸蟲童蟲中（12d），繼續(xù)培養(yǎng)3d，免疫印跡分析表明蟲體內(nèi)SjIAP蛋白表達有所下降，特別是siRNA－951組尤為明顯。Caspase活性測定表明在SjIAP敲降后的蟲體中Caspase 3／7活性有所提高，提示蟲體細胞凋亡進行可能有所增強，有待后續(xù)研究深入查明。

免疫印記分析表明干擾后蟲體IAP蛋白的表達有所降低，但實時定量RT－PCR和半定量PCR分析表明其mRNA在轉(zhuǎn)錄水平變化不明顯。我們推測可能由于SjIAP的mRNA量較高（比內(nèi)參NADH還高），在干擾效果有限的情況下，導致IAP轉(zhuǎn)錄水平干擾效果不明顯。另外，也可能由于siRNA－951分子主要引起IAP蛋白的翻譯抑制，有待進一步研究查明。

總之，本研究獲得了2個干擾SjIAP較好的siRNA分子，為進一步利用此分子，研究SjIAP的功能奠定了前期基礎。

[1]Zheng Q，Chen Y，Zhang HB，et al.The control of hookworm infection in China[J].Parasit Vectors，2009，2：44.

[2]Hotez PJ，Brindley PJ，Bethony JM，et al.Helminth infections：the great neglected tropical diseases[J].J Clin Invest，2008，118（4）：1311－1321.

[3]Lee EF，Clarke OB，Evangelista M，et al.Discovery and molecular characterization of a Bcl－2－regulated cell death pathway in schistosomes[J].Proc Natl Acad Sci USA，2011，108：6999－7003.

[4]Peng J，Yang Y，F(xiàn)eng X，et al.Molecular characterizations of an inhibitor of apoptosis fromSchistosomajaponicum[J].Parasitol Res，2010，106：967－976.

[5]Luo R，Zhou C，Shi Y，et al.Molecular characterization of a cytokine－induced apoptosis inhibitor fromSchistosomajaponicum[J].Parasitol Res，2012，111（6）：2317－2324.

[6]Lüder CG，Gross U，Lopes MF.Intracellular protozoan parasites and apoptosis：diverse strategies to modulate parasite host interactions[J].Trends Parasitol，2001，17（10）：480－486.

[7]James ER，Green DR.Manipulation of apoptosis in the host－parasite interaction[J].Trends Parasitol，2004，20（6）：280－287.