低水平乙型肝炎病毒表面抗原S區(qū)序列分析

計玉仙，張志明，李建平，姜小建，肖改娥，馬 瑩，舒 放，姜立茹，王 鑫

（西安市中心醫(yī)院 檢驗科，陜西 西安710003）

乙型病毒性肝炎是一種嚴重影響人類健康的危害性疾病，目前全球至少約有3億乙型肝炎病毒攜帶者，感染乙型肝炎病毒可引起不同程度的急、慢性肝臟疾病［1］，近年來由于乙型病毒性肝炎疫苗、高效價免疫球蛋白以及抗病毒藥物的廣泛應(yīng)用，造成部分乙型肝炎病毒表面抗原變異呈低水平表達［2］，臨床上乙型肝炎病毒表面抗原含量大于0.15μg/L而小于5μg/L定義為低水平乙型肝炎病毒表面抗原，其成因較多［3］，本文就37例低水平乙型肝炎病毒S區(qū)特征進行初步研究和探索，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源

選取西安市中心醫(yī)院2010年5月－2012年8月間門診及住院37例低水平乙型肝炎病毒表面抗原患者，年齡23－64歲，平均年齡41±19歲，其中男18例，女19例，多次檢測者只取首次資料，待測標本放置－20℃保存。

1.2 引物設(shè)計 根據(jù)美國GeneBank公布的HBV全基因序列，在S區(qū)設(shè)計兩條引物，內(nèi)引物Primer Pair1正 向 5’－TGTTTGCTGTACAAA－3’，反 向5’－TGGGAGTGGGCC－3’，外引物Primer Pair2正向 5’－TCACTACCAGCACG－3’， 反 向 5’－TCAGTTTACTAGT－3’引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.3 主要試劑與儀器 PCR Premix、Loading Buffer、Lysis Buffer（寶生物工程大連有限公司）、瓊脂糖（BBI公司）、DL2000DNA Marker（MBI公司）、UNIQ－10核酸純化柱（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）、化學(xué)發(fā)光試劑盒（鄭州安圖綠科生物工程有限公司），HBsAg中和確認試劑盒（珠海麗珠試劑股份公司）、HBsAg標準物質(zhì)2μg/L購自康徹思坦生物公司。鄭州安圖綠科生物工程有限公司LUMO－Autobio化學(xué)發(fā)光儀、美國應(yīng)用生物公司ABI7300基因擴增檢測儀、北京六一DYY－2C電泳儀、美國應(yīng)用生物公司ABI3730測序儀。

1.4 方法

1.4.1 低水平HBsAg篩查及確認 采用酶聯(lián)免疫ELISA法和化學(xué)發(fā)光法檢測HBsAg并用HB－sAg中和試驗進行確認［4］。

1.4.2 HBV－DNA模板的提取 取100μL血清加入等量DNA濃縮液震蕩5s，12 000r/min離心10 min，去上清，沉淀中加入20μl DNA提取液，劇烈震蕩5－10s，瞬間離心數(shù)秒，100℃金屬浴處理10 min后12 000r/min離心5min。上清液2μl作為1st PCR的模板。

1.4.3 PCR 反應(yīng)條件 （1）1st PCR反應(yīng) 在PCR反應(yīng)管（0.5ml）中加入2×PCR Premix 12.5μl，再向此反應(yīng)管中加入2μl已處理好的標本和10.5μl的Primer Pair 1，高速離心數(shù)秒。按以下條件進行1st PCR反應(yīng)94℃ 預(yù)變性1min，92℃變性30sec，55℃退火30s，72℃延伸5min共30個Cycles（2）2nd PCR反應(yīng) 在PCR反應(yīng)管0.5ml中加入2×PCR Premix 12.5μl，再向此反應(yīng)管中加入2μl的1st PCR擴增液和10.5μl的Primer Pair 2，高速離心數(shù)秒，按以下條件進行2nd PCR反應(yīng)92℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸7min共35個Cycles。

2 結(jié)果

2.1 電泳結(jié)果判定 向2nd PCR擴增液中加入5 μL的6×Loading Buffer，混勻后取10－15μL進行2%的瓊脂糖凝膠電泳。PCR擴增液在230bp附近有DNA亮帶，則此標本也可以判定為陽性（相當于HBsAg陽性）；如果2nd PCR擴增液在230bp附近沒有DNA亮帶，則此標本可判定為陰性。Control實驗時，2nd PCR擴增液在350bp附近有DNA亮帶（圖1）。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 HBV血清學(xué)分型判定

HBV的血清學(xué)分型是由HBsAg第122個和第166個氨基酸是賴氨酸（或精氨酸來決定的。而實際上是由下述框中的DNA堿基（A或G）來決定的，決定d/y的堿基：（A－－d，G－－y）；決定r/w 的堿基：（A－－w，G－－r）。用2nd PCR擴增產(chǎn)物進行 DNA序列測定，測序結(jié)果（圖2）按照以下標準（圖3）判斷其乙肝病毒的亞型（Adw、Adr、Ayr及Ayw）。

37例低水平乙型肝炎病毒表面抗原標本中，成功擴增并測序32份，其余5份擴增產(chǎn)物因不滿足測序要求（沒出現(xiàn)目的條帶或條帶質(zhì)量不高）無法進行S區(qū)序列分析，32份成功測序標本經(jīng)經(jīng)美國國立醫(yī)學(xué)圖書館中Genotyping在線分析，B型20例（62.5%，20/32），C 型12例（37.5%，12/32），與 Gene－Bank中收錄的AF100309、AB014381參考序列同源性最高；血清學(xué)分型18例為adr，10例為adw，3例為ayw，1例為ayr，并發(fā)現(xiàn)21例S區(qū)核酸序列發(fā)生 點 突 變，突 變 率 為 （65.6%，21/32）分 別 為A514C、T562A 、G587A、A589C各1例，G508A、G509A、A529G、T531C、T581A 各 2 例，3 例G511A、4例G508C。

3 討論

圖2 低水平乙型肝炎病毒表面抗原S區(qū)測序結(jié)果

圖3 乙肝病毒血清學(xué)分型（Adw、Adr、Ayr及Ayw）判定標準

乙型肝炎病毒簡稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，主要分為A－H 8個基因型，由于基因型分布與地域和人群密切相關(guān)，國內(nèi)學(xué)者對各地HBV基因型分布已進行了廣泛研究，2011年王林川［5］等對西安地區(qū)348例乙肝患者分型表明HBV B基因型87例（24.2%）；C型233例（64.7%）；B＋C混合型2例（0.56%），未檢出 A、D、E、F、G、H 型，與本文32份該地區(qū)低水平乙型肝炎病毒B型20例（62.5%，20/32），C型12例（37.5%，12/32）研究群體有明顯差異（P＜0.01）。

HBsAg是乙肝病毒包膜的主要蛋白，HBsAg有一個特異的共同抗原決定簇“a”和至少兩個亞型決定簇“d/y”和“w/r”，根據(jù)其抗原性的不同主要分為4個血清型（HBsAg的亞型）即Adw、Adr、Ayr、Ayw，最常見的血清型為Adw、Adr和ayw，我國絕大數(shù)地區(qū)以Adr為主，Adw次之，新疆、西藏、內(nèi)蒙古［6－8］等自治區(qū)的本地民族幾乎全為Ayw。32例低水平乙型肝炎經(jīng)血清學(xué)分型18例為Adr，10例為Adw，3例為Ayw，1例為 Ayr，血清型分布與一般乙型肝炎病毒血清型分布無差異。

HBV DNA聚合酶因缺乏矯正功能，乙肝病毒是突變頻率很高的DNA病毒，尤其在目前抗病毒藥物廣泛應(yīng)用的情況下［9］，本研究中共有21例低水平乙型肝炎病毒表面抗原S區(qū)發(fā)生突變，突變率為65.6%，其中15例突變不會引起編碼抗原決定簇氨基酸突變，為無義突變，突變點分別是A514C、T562A各1例，G508A、G509A、A529G各2例，3例G511A、4例 G508C，而其他6例如 T531C、T581A各2例，G587A、A591C各1例核苷酸點突變均可引起抗原決定族編碼的氨基酸的改變?nèi)鏘126T、S143T、G145R、N146T，從而導(dǎo)致表面抗原結(jié)構(gòu)改變。

乙型肝炎病毒表面抗原S區(qū)核苷酸編碼的變異可能導(dǎo)致臨床上常規(guī)檢測方法無法準確檢測而導(dǎo)致漏檢、誤診，也可能因為S區(qū)核苷酸編碼的變異導(dǎo)致臨床常規(guī)治療無效，總之，對低水平乙型肝炎病毒表面抗原患者S區(qū)序列的研究將為低水平乙型肝炎發(fā)病機制、流行病學(xué)以及個體化治療奠定基礎(chǔ)。

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［5］王林川，陳 葳，張阿麗.應(yīng)用nested－PCR對西安市乙肝病毒基因型的研究［J］.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27（7）：803.

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