芹菜籽中黃酮成分的提取純化及LC-MS檢測(cè)

姜笑寒 孟 青 劉莉蘭 劉紅梅

1.廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東廣州 510663；2.廣東藥學(xué)院 中心實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510224

旱芹（Apium Graveolens，celery）為傘形科一年生或二年生草本植物，異名香芹、藥芹等[1]。芹菜籽為傘形科植物旱芹Apium graveoleus L.var.dulce DC.的干燥成熟果實(shí)。目前研究表明芹菜籽具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血壓等多種藥理活性[2]。芹菜籽主要含有揮發(fā)油成分、苯酞類衍生物、香豆精類成分、黃酮及其甙類成分[3]。其中黃酮類成分主要有3'-甲氧基木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙，芹菜甙，木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙[4]。本試實(shí)驗(yàn)采用醇提取的方法對(duì)去油后芹菜籽中的黃酮成分進(jìn)行提取，大孔樹脂和聚酰胺柱分離純化提取物，得到三個(gè)含黃酮成分的洗脫液，采用LC-MS法對(duì)其進(jìn)行了檢測(cè)，推測(cè)40%乙醇洗脫液含有的主要成分為木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙，芹菜甙，3'-甲氧基木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙。

1 儀器、試劑與藥材

1.1 儀器

提取罐（弘荃機(jī)械企業(yè)有限公司）；KQ-400DB型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；雙口4列電熱恒溫水浴鍋（江西新建醫(yī)療器械廠）；電子天平（sartotius德國(guó)產(chǎn)）；DZF-6021型真空干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DRT-SX型恒溫電熱套（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；RE-52旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器（上海亞榮深化儀器廠）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；Waters 2695－2487 HPLC（Waters公司）；LCQ DECA XP液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Thremo公司）。

1.2 試劑與藥材

乙醇（天津富宇精細(xì)化工有限公司）；甲酸（廣州市東紅化工廠）；磷酸（色譜醇）（天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）；甲醇（色譜醇）、乙腈（色譜醇），（Tedia Company Inc.USA）；蒸餾水、二次去離子水（實(shí)驗(yàn)室自制）；大孔吸附樹脂D-16（中國(guó)滄州遠(yuǎn)威化工有限公司）；80～100目聚酰胺樹脂（浙江臺(tái)州路橋四甲生化塑料廠）；芹菜籽（廣東澄海明豐種子有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 制備芹菜籽黃酮

超臨界萃取后的芹菜籽，取5 kg，加80%乙醇于提取罐中80℃回流提取3次，每次加80%乙醇10倍量，提取1 h。合并三次提取液，提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇，濃縮液于80℃水浴上揮干，真空干燥，得到粗提物，出膏率為14.6%。

2.2 大孔吸附樹脂和聚酰胺樹脂純化[5-6]

填裝大孔樹脂 D-16柱子，活化處理好后，濕法上樣粗提物，依次用水，10%乙醇，20%乙醇洗脫，40%乙醇，60%乙醇，95%乙醇洗脫完全，收集各洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收乙醇，濃縮液于80℃水浴上揮干，真空干燥，得到初級(jí)純化部分。填裝聚酰胺柱，處理后取40%乙醇、60%乙醇洗脫液的初級(jí)純化部分，拌樣上聚酰胺柱，依次用水，40%乙醇洗脫，收40%洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮液于80℃水浴上揮干，真空干燥，得到純化部分。

2.3 LC檢測(cè)

2.3.1 液相色譜條件 色譜柱為：Zorbax ExtendC18柱，2.1 mm×25 mm，5 μm；柱溫30℃；流動(dòng)相：甲醇－水－磷酸（33:67:0.4）；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：340 nm；記錄時(shí)間：45 min。

2.3.2 檢測(cè) 將純化后的提取物用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，過(guò)0.2微孔濾膜后LC分析，得到純化后的芹菜籽黃酮色譜圖（圖1）。

2.4 LC．MS檢測(cè)

2.4.1 色譜條件 色譜柱為：Zorbax ExtendC18柱，2.1 mm×25 mm，5 μm；柱溫30℃；流動(dòng)相：甲醇－水－磷酸（33:67:0.4）；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：340 nm；記錄時(shí)間：45 min。

2.4.2 質(zhì)譜條件 離子化方式ESI（負(fù)離子方式）；掃描范圍：m/z200～800；干燥氣流10 mL/min；干燥器溫度：350℃；霧化氣壓：310kPa；毛細(xì)管電壓3500V；碎裂器電壓：70V。

2.4.3 檢測(cè) 對(duì)純化后的芹菜籽黃酮處理（處理方法同2.3.2），進(jìn)行LC－MS分析，并對(duì) 40%乙醇洗脫部分1，2，3峰進(jìn)行了成分推測(cè)（表1）。

3 討論

①考察提取方法時(shí)，根據(jù)文獻(xiàn)[7-8]先采用了單因素實(shí)驗(yàn)確定了乙醇濃度和提取溫度，然后通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)考察提取時(shí)間、提取次數(shù)和料液比對(duì)黃酮提取率的影響。確定提取工藝即十倍溶劑量提取三次，每次提取3 h?？紤]到時(shí)間影響因素對(duì)黃酮提取率最弱，再加上經(jīng)濟(jì)因素，最終確定提取工藝：80%乙醇溶液，80℃的條件下，以10倍溶劑量，提取3次，每次1 h。

②采用 LC－MS分析時(shí)，因?yàn)辄S酮結(jié)構(gòu)中含有較多的酚羥基，呈現(xiàn)弱酸性，易失去H，所 以選取了電噴霧負(fù)離子模式（ESI），形成 [M－H]－離子，通過(guò)碎片及分子量初步推斷，三類黃酮苷類化合物所帶糖基基本一致，均為一個(gè)木糖和一個(gè)葡萄糖。結(jié)果顯示（見(jiàn)表1）：保留時(shí)間為27.60 min的化合物，其[M—H]一質(zhì)荷比（m/e）為579，有285和447碎片峰，推測(cè)其為木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙；保留時(shí)間為46.1 min的化合物，其[M－H]－質(zhì)荷比（m/e）為564，有431和269碎片峰，推測(cè)其為芹菜甙；保留時(shí)間為53.7 min的化合物，其[M－H]－質(zhì)荷比（m/e）為594，有299和461碎片峰，推測(cè)其為3'-甲氧基木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙。

圖1 純化后的芹菜籽黃酮色譜圖

表1 40%乙醇洗脫部分 1，2，3峰成分推測(cè)

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用醇提法提取去油后芹菜籽中的黃酮成分，大孔樹脂和聚酰胺進(jìn)行分離純化 ，液相色譜．質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)到黃酮成分主要在40%乙醇洗脫部分，并對(duì)40%乙醇洗 脫部分成分進(jìn)行了推測(cè)，推測(cè)其含有的主要成分為木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙，芹菜甙，3'-甲氧基木犀草素-7-洋芫荽糖-葡萄糖甙。結(jié)果說(shuō)明此提取純化方法具有可行性。

[1] 劉詠松.芹菜的本草研究及功用[J].四川中醫(yī)，2004，22（7）：25-26.

[2] 王文寶，馬華夏，宋春梅.芹菜籽化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，33（1）：49-51.

[3] 呂金良，牟新利，王武寶，等.近年來(lái)維藥芹菜籽揮發(fā)油化學(xué)成分研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17（1）：6-7.

[4] 上海中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典（上）[M].2版.上海：上海科技出版社，1997.

[5] 謝遠(yuǎn)紅.大孔吸附樹脂純化芹菜黃酮的研究[J].廣東化工，2012，39（5）：30-31.

[6] 嚴(yán)志慧，陳亮，羅軍武，等.聚酰胺樹脂分離純化芹菜黃酮的工藝研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（1）：85-88.

[7] 張洪杰，李小吉.芹菜葉中黃酮類化合物的提取浴測(cè)定[J].廣東化工，2011，38（1）：201-203.

[8] 謝遠(yuǎn)紅.芹菜總黃酮提取工藝研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（9）：256-258.