外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及染色體高分辨標(biāo)本制備方法

劉愛生，朱春燕

(甘肅省平?jīng)鲠t(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，平?jīng)?744000)

人類染色體G顯帶高分辨核型分析，是臨床檢測診斷染色體畸變常用方法，國內(nèi)公認(rèn)常規(guī)制作方法因步驟繁雜，實驗周期長，收獲到的中期染色體局限了基因定位和G顯帶分析疾病的診斷。核型分析時，在短時間內(nèi)能檢診到大量的分散均勻的早中期及中期染色體，是臨床工作者所渴求的。我們在實驗教學(xué)中主要改變了細(xì)胞培養(yǎng)的方法;最低濃度的秋水仙素處理和最短阻斷培養(yǎng)時間，最小錐度的10 ml尖底細(xì)長離心管收集細(xì)胞和斜滴片法，取得了良好的收效，現(xiàn)報告如下。

1 實驗方法

收集每次實驗課后成敗相關(guān)數(shù)據(jù)，分析總結(jié)標(biāo)準(zhǔn)方法［1］的經(jīng)驗，制作方法宜改進(jìn)如下:

1.1 接種培養(yǎng) 需在無菌環(huán)境條件下進(jìn)行，無菌室內(nèi)正常消毒，工作前半小時超凈工作臺紫外線照射30 min。取出冰凍保存5 ml/每瓶1640混合培養(yǎng)液先室溫融化，再置入37℃水浴箱內(nèi)預(yù)溫止37℃，操做者雙手40℃水預(yù)溫繼續(xù)無菌操作，用3 ml肝素真空抗凝管，瓶蓋、皮膚常規(guī)消毒，取肘部靜脈血3 ml輕輕轉(zhuǎn)動搖勻抗凝管，起到充分的抗凝作用，用1 ml滅菌注射器吸取0.5 ml抗凝血(37℃)，迅速接種于提前室溫融化后再經(jīng)37℃水浴箱預(yù)溫的5 ml的1640混合培養(yǎng)液內(nèi)，消毒封蓋立即放入37℃電子調(diào)控隔水式恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)51 h［2］。培養(yǎng)過程每隔8 h輕輕搖晃培養(yǎng)物一次。

1.2 最低濃度秋水仙素處理和最短阻斷培養(yǎng)時間經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)的細(xì)胞，培養(yǎng)至50 h25 min時用微量移液器加40 μg/L的秋水仙素55 μl，繼續(xù)阻斷培養(yǎng)51 h終止培養(yǎng)，收集染色體。培養(yǎng)至50 h 45 min時用微量移液器加 40 μg/L 秋水仙素 60 μl，繼續(xù)阻斷培養(yǎng)51 h終止培養(yǎng)，收集染色體。終止前1 min將培養(yǎng)物搖勻傾斜移入最小錐度的10 ml錐型離心管內(nèi)，取1 ml生理鹽水清洗全部血細(xì)胞移入此離心管內(nèi)，并對稱放入電腦調(diào)控的離心機內(nèi)，以2 000 rpm離心10 min，終止細(xì)胞培養(yǎng)?；蛘哂猛鹊蜐B法阻斷收集［3］;細(xì)胞培養(yǎng)止51 h時將培養(yǎng)物搖勻傾斜移入最小錐度的10 ml錐型離心管內(nèi)，取1 ml生理鹽水清洗全部血細(xì)胞移入此離心管內(nèi)，以2 000 rpm離心10 min，棄取上清液，保留底物1 ml加入預(yù)溫37℃，0.075 mol/L 的 KCl 4 ml，用微量移液器隨即加 40 μg/L 秋水仙素 57.5 μl，迅速吹打均勻，置于37℃水浴箱內(nèi)低滲24 min，加3∶1固定液0.6 ml打勻預(yù)固定1 min，以2 000 rpm離心10 min(注意:吸取培養(yǎng)液的量與所加低滲液的量必須相等，以免影響秋水仙素的濃度)。

1.3 選取最小錐度10 ml尖底細(xì)長潔凈的離心管收集細(xì)胞，每管培養(yǎng)物制0.4 ml的細(xì)胞懸液吹打均勻，改斜滴片法，滴片時玻片與水平位呈45°夾角以20cm的高度2滴滴于熱玻片或者冰凍玻片中央。待室溫干燥后，浸入30%過氧化氫處理10 min［4］，自來水徹底沖洗，用EDTA胰酶法或PBS胰酶緩沖法作顯帶處理。Giemsa(1 Giemsa∶9自來水)染色10～15 min，細(xì)流水沖洗。晾干，顯微鏡40×10倍視野觀察玻片標(biāo)本制作良好，用中性樹膠加二甲苯調(diào)試成線狀，取2滴滴于細(xì)胞面中央，蓋玻片呈30°角鋪于玻片上封片，即可在高倍鏡下鑒定，鋪平室溫放置3 d樹膠干燥制作成永久性保存標(biāo)本片，供長期使用保存。

2 結(jié)果

改進(jìn)制作方法簡單，制作總程由72 h縮短至54 h既可做為臨床標(biāo)本診斷，如表1所示［5-7］。一張玻片10×10倍視野下可記32個分裂量(圖1)，即可見早中期，部分中期兼有早期分裂相，加之斜滴片法和30%過氧化氫處理，染色體分散均勻，帶紋顯示更加精細(xì)、清楚;尤其是獲得的大量早中期，中期分裂相(圖2)，符合統(tǒng)計學(xué)分析細(xì)胞數(shù)的要求。實驗共61個班級，每班分8個小組進(jìn)行，分裂指數(shù)數(shù)據(jù)分析如表2所示。

表1 常規(guī)、文獻(xiàn)與實驗結(jié)果比較

表2 實驗分裂指數(shù)結(jié)果

3 討論

3.1 離體抗凝血細(xì)胞培養(yǎng)生長環(huán)境和細(xì)胞周期的準(zhǔn)確時間 在離體培養(yǎng)條件下，一個存活細(xì)胞可繁殖成一個細(xì)胞群體［8］，細(xì)胞培養(yǎng)過程中的溫度和營養(yǎng)對細(xì)胞生長發(fā)育活力速度有極大影響。每一粒離體培養(yǎng)細(xì)胞繁殖能力和在人體內(nèi)細(xì)胞一樣，需要細(xì)心培養(yǎng)，讓它不受外界刺激干擾，提供它適宜的生存環(huán)境，方可良好分裂，故需要嚴(yán)格的無菌操作。采取新鮮離體抗凝血［9］(37℃)，迅速接種與預(yù)溫37℃的1640混合培養(yǎng)液內(nèi)，繼續(xù)37℃恒溫培養(yǎng)，保護(hù)細(xì)胞的發(fā)育與分裂活力，使離體抗凝血細(xì)胞跳過低溫休克期，同在機體內(nèi)37℃生存環(huán)境一樣，保持原有的活力繼續(xù)生長。在這種良好適宜細(xì)胞生長的環(huán)境條件下，通過混合培養(yǎng)液內(nèi)植物血凝素(phytohemagglutin，PHA)作用刺激，促幼稚淋巴細(xì)胞成熟。其中，小牛血清是促生長因子，同時培養(yǎng)基還提供營養(yǎng)作用及雙抗的保護(hù)。培養(yǎng)過程中每隔8 h輕輕搖蕩沉淀血細(xì)胞，使每一粒細(xì)胞均勻的吸收營養(yǎng)和均勻獲取分裂能力。離體恒溫37℃培養(yǎng)至50 h后大量的存活細(xì)胞已經(jīng)逐漸獲得了旺盛的分裂能力，完成細(xì)胞間期進(jìn)入分裂期。此時即用低濃度的秋水仙素短時間阻斷培養(yǎng)，便獲得第一次早期，中早期，中期分裂相，這一簡單的過程保護(hù)了大部分細(xì)胞在遇低溫時休克失活，創(chuàng)造了細(xì)胞良好的生存環(huán)境，提高了細(xì)胞分裂能力并加快了細(xì)胞生長速度，而使細(xì)胞培養(yǎng)時間縮短至51 h，增加了分裂量及可見大量中早期、中期、兼有早期分裂相(圖1)。我們實驗證明采用的離體抗凝血放置時間越長越不易細(xì)胞培養(yǎng)。冷凍的抗凝血細(xì)胞會導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。若不預(yù)溫或遭遇中途停電，溫度降低會使分裂量減少、細(xì)胞培養(yǎng)生長速度減慢，培養(yǎng)時間延長和只收集到堆積的不夠舒展部分中期染色體分裂相。

3.2 細(xì)胞周期中分裂期的獲得 細(xì)胞周期中分裂期一般持續(xù)0.5～2 h，細(xì)胞分裂中期總程是20 min［10］。已獲得分裂能力進(jìn)入分裂早期的培養(yǎng)細(xì)胞，由染色質(zhì)逐漸螺旋化凝縮形成染色單體，此期也是細(xì)胞有絲分裂器紡錘體形成時期［11］，秋水仙素具有抑制細(xì)胞分裂前期紡錘體的形成，使細(xì)胞分裂停留在中期，以積累大量分裂中期細(xì)胞［12］。中期染色體達(dá)到凝縮高峰，輪廓清楚，便于觀察。在細(xì)胞周期中染色體經(jīng)歷著凝縮和舒展的周性的變化。它的濃度和阻斷培養(yǎng)作用的時間影響染色體的結(jié)構(gòu)形態(tài)，不同分裂時期的細(xì)胞被阻斷到中前期染色體呈細(xì)長條狀，中期呈棒狀，中后期臂粗短，末期凝縮為染色質(zhì)，秋水仙素的濃度和阻斷培養(yǎng)作用時間需精確到最小濃度和最佳時間，才能夠收集到分裂早期、早中期、中期染色體分裂相［13］。濃度過大產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用則染色體形態(tài)快速凝縮使分裂相減少和染色體臂短粗、表面毛糙、邊緣不齊、使明暗帶紋顯示不清，影響G顯帶制備效果。若阻斷培養(yǎng)時間超時則染色體形態(tài)在秋水仙素的作用下逐漸凝縮，使染色體丟失制片失敗。此期是制作染色體標(biāo)本的關(guān)鍵步驟，確定好秋水仙素的量和對應(yīng)的阻斷培養(yǎng)時間，即從加秋水仙素計時起至開始離心的時間，為秋水仙素阻斷培養(yǎng)的準(zhǔn)確時間。若超時5 min，分裂相減少1/3，超時 10 min，分裂相減少減少 1/8，超時 15 min，分裂相減少1/9甚至完全凝縮為染色質(zhì)。秋水仙素阻斷培養(yǎng)作用最短時間在15 min內(nèi)取40 μg/L的秋水仙素60 μl，25 min 內(nèi)取40 μg/L 秋水仙57.5 μl，35 min 內(nèi)取 40 μg/L 秋水仙素 55 μl，45 min 內(nèi)取 40 μg/L 秋水仙素 52.5 μl。最短阻斷培養(yǎng)時間和相應(yīng)最低濃度秋水仙素的量，使收集到染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)處早中期和中期的最佳狀態(tài)(圖2)。

3.3 取最小錐度的10 ml尖底細(xì)長離心管 此是增加收集分裂量的關(guān)鍵步驟。由于低滲過的細(xì)胞其重力增加，受離心力的影響通過離心管壁的長度和錐度使染色體受到沉降作用，而易于收集。10 ml尖底離心管的錐度和長度不同，收集到的分裂量也不同，離心管的錐度越小收集到的分裂量越多。相反，錐度大和管壁長度不夠而使細(xì)胞沉降不夠，使部分染色體丟失，則收到的分裂量也甚少。斜滴片法;保持20 cm高度，滴片時產(chǎn)生的角度使細(xì)胞膜先被擦破，而使每條染色體順著玻片角度自然散開黏附于熱玻片或冰凍的玻片上，使各期染色體形態(tài)不易折疊而均勻的分散，更便于觀察分析。每次固定靜置10 min有利于清除胞漿背景和固定染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用。避免酒精燈過多烤片，由于火焰溫度很難掌握，過高影響胰酶消化帶紋的顯示。

本方法拓展了G顯帶檢診范圍，使臨床分析診斷深入研究人類染色體G顯帶畸變和基因定位更精確，廣泛，快捷。有報到48 h可收集中期分裂相［12］，但標(biāo)本分裂相甚少，很難達(dá)到臨床分析統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)方法約72 h完成，收集到部分中期分裂相，錯過了細(xì)胞第一次分裂時期，收集到少部分中期和中后期分裂相，局限了G顯帶帶紋的分布，使染色體畸變分析診斷基因定位受到局限。改進(jìn)制作方法簡單，方便，值得推廣。

［1］李 潔，徐文瑜，楊嬌英.外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及染色體G顯帶高分辨的實驗對策［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2006，14(1):51.

［2］熊曉蕓.秋水仙素濃度對人體外周血淋巴細(xì)胞染色體標(biāo)本制備的影響［J］.江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2009，6，20(2):54-56.

［3］王立斌，王貴杰，潘月英.高分辨染色體制備及顯帶方法的改良效果分析［J］.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2009，4:31.

［4］馮 治，黃元河.外周血高分辨染色體制備方法研究［J］.臨床與實驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，8:1139-1141.

［5］楊艷芳，王宗霞，崔占前，等.人類染色體G顯帶核型技術(shù)研究進(jìn)展［J］.科技創(chuàng)新導(dǎo)報雜志，2010，16:13.

［6］董 爍，謝振興.淺談人體外周血淋巴細(xì)胞染色體的制備［J］.食品工程雜志，2008，2:25-27.

［7］趙小平，余 紅，黃 燕，等.外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及染色體G顯帶標(biāo)本制備技術(shù)的改良［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2009，36(11):2108-2109.

［8］劉樹錚，主編.醫(yī)學(xué)放射生物學(xué)［M］.第2版.北京:北京原子能出版社，2010，8:103-126.

［9］韓 晶，李 洋.外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及制備染色體G顯帶的技術(shù)研究［J］.中國實驗診斷學(xué)雜志，2011，15(7):1177-1178.

［10］張忠壽，主編.細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)［M］.第2版.北京:

人民衛(wèi)生出版社，2008:1.

［11］張麗華，鄒向陽，主編.細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)［M］.第4版.北京:北人民衛(wèi)生出版社，2011:6.

［12］馬 強，劉青松，蔡 燕.外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備的幾點體會［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，9(32):1641-1642.

［13］劉愛生，朱春燕.秋水仙素在人類染色體G顯帶制作中的應(yīng)用與討論［J］.衛(wèi)生職業(yè)教育雜志，2012，30(23):107-108.