雞新城疫抗體監(jiān)測(cè)和免疫程序的研究

潘百明，馮曉穎

（賀州學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 賀州 542899）

1 前 言

雞新城疫（Newsastle disease，ND）是由新城疫病毒引起禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病，又稱偽雞瘟，亞洲雞瘟；該病以高熱、呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、黏膜和漿膜出血為特征，具有很高的發(fā)病率和病死率，是危害禽業(yè)的一種主要傳染病，OIE將其列為A類疫?。?］。

崔永琴等人對(duì)新疆昌吉地區(qū)TK肉雞養(yǎng)殖基地的8個(gè)規(guī)模化養(yǎng)雞場(chǎng)進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)商品肉雞新城疫進(jìn)行抗體檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞群新城疫血清抗體水平偏低，然后根據(jù)各場(chǎng)的實(shí)際情況對(duì)雞群制定不同的免疫程序，進(jìn)行免疫效價(jià)對(duì)比，試驗(yàn)表明在雞群接種新城疫的1組免疫程序中，1號(hào)免疫程序免疫效果最好，為最佳免疫程序［2］。李翠蓉等在《涼山彝族地區(qū)雞新城疫免疫程序試驗(yàn)探討》這一論文中，通過(guò)對(duì)532只受試雞群不同免疫程序試驗(yàn)研究表明，2年以上的老雞在1年1次I系肌注免疫后9個(gè)月 HI抗體 均值 為 6．29（log2），或高達(dá) （8 ～9）log2，攻毒保護(hù)100%。1年以內(nèi)的新雞常規(guī)免疫后HI抗體值為4．53（log2），已接近免疫臨界線水平，攻毒保護(hù)僅80%。針對(duì)廣大農(nóng)村特別是少數(shù)民族地區(qū)，在新雞老雞混合放養(yǎng)，且不具備免疫檢測(cè)條件的現(xiàn)狀，意在探討制定一個(gè)合理的免疫程序，給新城疫流行地區(qū)的雞群提供強(qiáng)有力的保護(hù)［3］。曹立輝等人為驗(yàn)證石家莊地區(qū)目前用于防治蛋雞新城疫免疫程序的科學(xué)性和合理性，試驗(yàn)對(duì)1000只海蘭灰蛋雞，按石家莊地區(qū)養(yǎng)雞戶目前廣泛應(yīng)用的免疫程序，分別于8、20、60、120日齡免疫新城疫LaSota疫苗或新城疫油乳劑滅活疫苗，并分別于不同日齡隨機(jī)選取30只采血分離血清，分別檢測(cè)新城疫HI抗體，觀察其消長(zhǎng)規(guī)律。結(jié)果表明，該免疫程序是比較科學(xué)合理的，對(duì)預(yù)防新城疫能夠起到保護(hù)作用［4］。

由上內(nèi)容看出，雞群免疫抗體的產(chǎn)生及維持時(shí)間的長(zhǎng)短受到雞群免疫應(yīng)答能力、所用疫苗種類、免疫方法、免疫次數(shù)、疾病流行狀況、地域、雞場(chǎng)選址等方面的影響，良好的免疫接種不等于雞群能夠產(chǎn)生良好的保護(hù)力，導(dǎo)致了至今仍沒(méi)有一套適合所有養(yǎng)雞場(chǎng)的免疫程序，我們可以參考其他的免疫程序，但不能直接套用，所以進(jìn)行新城疫的抗體監(jiān)測(cè)極為重要，根據(jù)實(shí)際情況，制定應(yīng)適的免疫程序。同時(shí)，在進(jìn)行監(jiān)測(cè)的過(guò)程中，當(dāng)出現(xiàn)抗體水平很低時(shí)，可進(jìn)行免疫程序的調(diào)整，避免雞群疫情的發(fā)生。

目前我國(guó)生產(chǎn)的雞新城疫疫苗有I、II、III、IV等4個(gè)品系［5］。I系疫苗毒力較強(qiáng)，IV系疫苗（Lasota系）毒力次之，II系疫苗（B1系）毒力較弱，III系疫苗（F系）毒力最弱［6］。II、III、IV 系苗適用于雛雞和成雞，I系苗只供兩個(gè)月以上的雞使用，接種后雖然引起的反應(yīng)比較重，然而免疫效力較強(qiáng)，適合于疫病嚴(yán)重流行的地區(qū)使用［7］。為安全起見(jiàn)，在使用I系苗之前，要先用II或III系苗進(jìn)行基礎(chǔ)免疫。

檢測(cè)雞新城疫的方法有以下幾種，分別是：病毒分離法、紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)和紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)、瓊脂糖凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫熒光實(shí)驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫組化技術(shù)和RTPCR技術(shù)［8］。本文采用紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)和紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)對(duì)賀州市三加高林養(yǎng)殖場(chǎng)1000羽產(chǎn)蛋雞進(jìn)行新城疫抗體水平監(jiān)測(cè)，分析抗體水平的消長(zhǎng)規(guī)律，制定出一套科學(xué)的適合賀州地區(qū)防治新城疫的免疫程序，為各養(yǎng)殖場(chǎng)新城疫的有效防治提供參考。

2 材料和方法

2．1 實(shí)驗(yàn)材料

2．1．1測(cè)試雞群

賀州市三加高林養(yǎng)殖場(chǎng)的農(nóng)大三號(hào)產(chǎn)蛋雞。

2．1．2 實(shí)驗(yàn)試劑

（1）新城疫抗原和標(biāo)準(zhǔn)血清（哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司）；（2）檸檬酸鈉（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）；（3）蒸餾水；（4）生理鹽水。

2．1．3 實(shí)驗(yàn)儀器

（1）離心機(jī)（TGL—16G上海安亭科學(xué)儀器廠）；（2）移液槍（北京青云卓立精密設(shè)備有限公司）；（3）JA2103N型電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；（4）96孔 V型板；（5）KS調(diào)速多用振蕩器（國(guó)華電器有限公司）；（6）冰箱。

2．1．4 主要溶液的配制

（1）抗凝劑的配制：用天平稱取3．8g檸檬酸鈉，加入100ml生理鹽水中，待完全溶解后即可使用。

（2）紅細(xì)胞懸浮液的制備：采取雞心臟或雞翅靜脈血液，放入加有抗凝劑的離心管內(nèi)（按抗凝劑：全血為1：2的比例）迅速混勻，以3000rpm／min轉(zhuǎn)速離心5min，吸棄上清液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，向沉淀的紅細(xì)胞加生理鹽水，混合均勻，再以3000rpm／min離心5min，吸棄上清液，重復(fù)以上步驟，反復(fù)離心4～5次，最后一次離心后，棄去上清液，即為紅細(xì)胞泥，放入40℃ 冰箱保存，使用時(shí)用1ml吸管吸取0．1ml紅細(xì)胞泥，加9．9ml生理鹽水，即1%紅細(xì)胞液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

（3）被檢血清：每只雞采心臟或雞翅靜脈血1ml，靜置，待血清析出后備用。

2．2 實(shí)驗(yàn)方法

2．2．1實(shí)驗(yàn)方案

（1）免疫程序：按照表1的免疫程序?qū)?shí)驗(yàn)雞群進(jìn)行新城疫免疫。

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（2）采樣：照表2進(jìn)行采樣：每次按20／1000羽隨機(jī)采血，每羽1ml采血量。

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2．2．2 新城疫抗原效價(jià)的測(cè)定方法

利用紅細(xì)胞凝集（HA）試驗(yàn)［9］測(cè)定出新城疫抗原的效價(jià)，為紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn)所需4單位抗原的配制做準(zhǔn)備。具體操作如下：

（1）每孔加入生理鹽水0．025ml。

（2）取病毒抗原0．025ml，加入第一孔，重復(fù)混勻4－6次后，吸0．025ml加入第二孔，如此連續(xù)稀釋至第十一孔后吸出0．025ml棄去。第12孔不加病毒液為紅細(xì)胞空白對(duì)照。

（3）向每孔加0．025ml濃度為1%的紅細(xì)胞懸浮液，振蕩1min，室溫靜置30min后觀察。

（4）結(jié)果判斷：沿著傾斜面向下呈線狀流動(dòng)者為沉淀，表明紅細(xì)胞沒(méi)有或不完全被病毒凝集；如果紅細(xì)胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動(dòng)，說(shuō)明紅細(xì)胞被病毒所凝集。能使雞紅細(xì)胞完全凝集的抗原最高稀釋倍數(shù)，稱為該抗原滴度紅細(xì)胞凝集效價(jià)，即沉淀的前一孔為該抗原的效價(jià)。

（5）實(shí)驗(yàn)測(cè)得本次研究所用抗原的效價(jià)為1：256，在HI試驗(yàn)中，為了要保證0．025ml抗原稀釋液內(nèi)必含有4個(gè)凝集單位，應(yīng)將抗原做256／4＝64倍稀釋。即取0．1ml抗原，加入6．4ml生理鹽水。

（6）4單位抗原校正：用移液器向v型板的第二孔至第六孔加0．025ml生理鹽水，第一孔不加；然后取4單位抗原0．025ml分別加入第一孔、第二孔，從第二孔開(kāi)始擠壓6次混勻后，吸0．025ml至第三孔，依次倍比稀釋至第五孔，棄0．025ml，六孔為空白對(duì)照；再吸0．025ml1%紅細(xì)胞懸浮液依次加1－6孔，置于振蕩器上振蕩1分鐘，室溫靜置30分鐘后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。觀察結(jié)果：

第一、二、三孔為完全凝集，四孔為50%沉淀，五孔、對(duì)照為完全沉淀，表明所配4單位抗原準(zhǔn)確，校正成立。

2．2．3 血清抗體水平的測(cè)定方法

利用紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn)［9］對(duì)雞血清樣品的抗體水平進(jìn)行檢測(cè)。具體操作如下：

（1）十一孔加0．05ml生理鹽水，其余每孔加0．025ml。

（2）吸取被檢血清0．025ml注入第一孔，反復(fù)混勻4－6次后，吸出0．025ml注入第二孔，如此連續(xù)稀釋至第十孔，并從第十孔吸出0．025ml棄去，血清稀釋倍數(shù)依次為1：2～1：1024，11孔和12孔空白。

（3）每孔再加入已標(biāo)定好的四單位病毒液0．025ml，第十一孔為紅細(xì)胞對(duì)照孔，不加病毒液。

（4）置振蕩器上振蕩1分鐘，18～22℃環(huán)境下靜置20分鐘。

（5）每孔再加入1%紅細(xì)胞懸浮液0．025ml，振蕩1分鐘，置于18－22℃環(huán)境下，40分鐘后判定結(jié)果。第十一孔為紅細(xì)胞對(duì)照孔，第十二孔作為抗原對(duì)照孔。

（6）結(jié)果觀察：將反應(yīng)板傾斜成45℃角，沉于管底的紅細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線狀流動(dòng)者為沉淀，表明紅細(xì)胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細(xì)胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動(dòng)，說(shuō)明紅細(xì)胞被病毒所凝集。能將4單位病毒物質(zhì)凝集紅細(xì)胞的作用完全抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為該血清的紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)，用被檢血清的稀釋倍數(shù)或以2為底的對(duì)數(shù)（log2）表示。如上例，該血清的紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)為1：64或HI效價(jià)為6（log2）。第十一孔僅含稀釋液和紅細(xì)胞為不凝集對(duì)照孔，第十二孔含稀釋液，病毒液和紅細(xì)胞為凝集對(duì)照孔。

3 結(jié)果與分析

3．1 被檢血清HI抗體保護(hù)率情況分析

2．2．2（HA）和2．2．3（HI）監(jiān)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

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由表3可知，3、50、130、300、379日齡的保護(hù)率為100%，全部達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)血清的抗體值；13、24日齡為首免前后的保護(hù)率，分別為40%和20%，此時(shí)如果雞群遇ND野毒侵襲，免疫水平低的雞極有可能發(fā)病。故應(yīng)立即進(jìn)行疫苗免疫。同時(shí)，也說(shuō)明，盲目免疫不一定能獲得良好的免疫效果。

3．2 產(chǎn)蛋雞在不同日齡的新城疫HI平均抗體水平分析

根據(jù)表3血清抗體平均值／log2得出該雞群新城疫抗體水平的變化規(guī)律（見(jiàn)圖1）。

從圖1可以看到：

（1）在測(cè)得的單組數(shù)據(jù)中無(wú)明顯的參差不齊現(xiàn)象，證明該雞場(chǎng)無(wú)野毒存在。

（2）經(jīng)微量法HI測(cè)得該雞群雛雞3日齡母源抗體為7．3（log2），高于標(biāo)準(zhǔn)血清7（log2），處于有免疫能力的抗體水平狀況，可產(chǎn)生一定的ND免疫力。觀察13日齡數(shù)據(jù)得其平均抗體水平已低于標(biāo)準(zhǔn)血清的抗體值，為提高其抵抗新城疫病毒的能力，考慮雛雞受母源抗體的影響，且其免疫器官發(fā)育尚不健全，免疫應(yīng)答能力較弱［10］，將首免提前至5－7日齡左右，進(jìn)行弱毒Ⅱ系疫苗免疫。

（3）通過(guò)對(duì)13日齡、24日齡、50日齡的抗體水平數(shù)值比較得出，在免疫后十天的抗體水平為4．9（log2）明顯低于免疫前的數(shù)值，說(shuō)明：其一，采取飲水的免疫方法可能會(huì)達(dá)不到想要的效果，造成免疫失?。黄涠?，Ⅱ系疫苗的免疫期時(shí)間短，很快就失去免疫效果；其三在免疫后，疫苗發(fā)揮其效果需要一段時(shí)間，在對(duì)比50日齡的抗體水平10（log2）以上即可看出疫苗發(fā)揮作用，到達(dá)峰值需三周左右。

（4）根據(jù)379日齡的抗體水平11．7（log2）判斷得出，該實(shí)驗(yàn)雞群有可能被強(qiáng)毒感染，故得到高水平的抗體值。

（5）分析109日齡、130日齡和145日齡的抗體水平也可得出第三點(diǎn)結(jié)論。

（6）二免后抗體水平與四免后的抗體水平相比較，由于疫苗毒力的關(guān)系，Ⅰ系疫苗達(dá)到的抗體水平峰值高于Ⅳ系疫苗所達(dá)到的抗體水平峰值；發(fā)揮效果的時(shí)間也是Ⅰ系疫苗較長(zhǎng)。

（7）總體分析血清的抗體曲線圖，除前50日齡出現(xiàn)低于標(biāo)準(zhǔn)血清的抗體水平7（log2）外，其余時(shí)間都明顯高于其抗體水平，說(shuō)明該免疫程序整體還是科學(xué)的，對(duì)于出現(xiàn)在24日齡的情況，為避免再次發(fā)生低于7（log2）的抗體水平，要根據(jù)情況及時(shí)追加一次Ⅳ系或Ⅰ系疫苗的免疫。

4 結(jié) 論

根據(jù)HI試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到，把首免時(shí)間制定在5－7日齡為宜。根據(jù)13日齡和24日齡這兩次的數(shù)據(jù)看出，均沒(méi)有達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)血清的抗體水平，極有可能在這段時(shí)間感染新城疫病毒，給養(yǎng)雞場(chǎng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，所以應(yīng)把第二次Ⅱ系飲水免疫提前，在14－16日齡為宜。在本次研究中，根據(jù)對(duì)賀州地區(qū)產(chǎn)蛋雞抗體免疫水平監(jiān)測(cè)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，微調(diào)其原來(lái)的免疫程序，提前做第三次免疫，減小了感染新城疫的可能。故建議的免疫程序?yàn)椋菏酌?－7日齡Ⅱ系克隆株疫苗飲水、點(diǎn)眼或滴鼻；二免14－16日齡Ⅱ系或Ⅳ系飲水、點(diǎn)眼或滴鼻；三免30－32日齡Ⅳ系飲水、點(diǎn)眼或滴鼻；四免60－70日齡Ⅰ系肌肉注射；五免110－120日齡Ⅰ系肌肉注射；后每五個(gè)月加免一次Ⅰ系肌肉注射。

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