氟苯尼考在大鼠腸內(nèi)吸收特征試驗

張建平，胡海英，張正全

（鄭州大學藥學院，河南 鄭州450001）

氟苯尼考（Florfenicol）是20世紀80年代由先靈－葆雅公司研制的一種新型獸醫(yī)專用氯霉素類廣譜抗菌藥，具有抗菌譜廣、體內(nèi)分布廣泛，特別是無潛在的致再生障礙性貧血的不良反應等特點，對敏感菌所致的畜禽細菌性疾病治療效果顯著。2000年該藥在我國批準為國家二類新獸藥，但在目前的氟苯尼考使用中存在不同劑型，及同一劑型的不同生產(chǎn)廠家產(chǎn)品在療效上存在巨大差異，因此有必要對氟苯尼考的溶解度行為、生物吸收行為進行研究，以期找到臨床療效差異的原因及為高效快速吸收的制劑提供參考。飽和溶解度是藥物重要的物理化學參數(shù)之一，藥物溶解度的大小及在吸收部位溶解的狀態(tài)直接影響了藥物的吸收。大鼠在腸內(nèi)循環(huán)模型研究藥物吸收的方法，能避免胃內(nèi)容物和消化道固有生理活動對結果的影響，可較客觀的反映藥物在腸道內(nèi)的實際吸收情況［1］。作者采用該模型考察了氟苯尼考的大鼠腸內(nèi)的吸收情況，為該藥設計適當?shù)慕o藥劑型提供一定參考。

1 材料

1．1 材料及儀器 氟苯尼考原料藥（湖北龍翔藥業(yè)有限公司，批號：101152）；0．9%生理鹽水（自制）、酚紅（分析純）、甲醇（色譜純）及其他試劑均為分析純；Angilent－1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AKasil C18色譜柱（Ajela博納艾杰爾科技有限公司）；UV－2102型紫外分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司）；DV15cd分析天平（梅特勒－托利多儀器公司，上海）。

1．2 試驗動物 清潔級健康大鼠，體重200g±10 g，購自河南省實驗動物中心，合格證號：410118。

2 方法

2．1 溶液的配制 Krebs－Ringer（K－R）磷酸緩沖液［2］：配制 pH 值7．4的 Krebs－Ringer磷酸鹽緩沖液；腸循環(huán)液：在K－R緩沖液中加入適量的酚紅和氟苯尼考，使酚紅濃度20μg／mL，氟苯尼考濃度分別為 50μg／mL、100μg／mL、200μg／mL，取 100 mL作為腸循環(huán)吸收液。

2．2 酚紅測定方法的建立 酚紅的最大吸收波長為558nm，用紫外可見分光光度計測定其濃度，圖譜顯示無其他雜質峰干擾，小腸對酚紅基本無吸收，因此可以通過酚紅的濃度校正循環(huán)液體積。

2．2．1 酚紅標準曲線的繪制 用K－R緩沖液配制100μg／mL的酚紅作為儲備液，用K－R緩沖液稀釋至不同濃度，得濃度分別為4．95、9．9、14．85、19．8、29．7μg／mL酚紅標準溶液。分別吸取上述濃度標準液0．5mL，置試管中，加入0．2mol／L氫氧化鈉溶液0．5mL，搖勻，微孔濾膜過濾，以0．2mol／L氫氧化鈉溶液為空白，在558nm處測定其吸光度A。

2．2．2 回收率測定 分別配制4．95、14．85、29．7 mg／mL酚紅標準液各3份，加入氟苯尼考原料藥，使其濃度為200μg／mL，按“2．2．1”項下方法處理，測定吸光度A，計算3種濃度酚紅的回收率。

2．3 氟苯尼考方法學建立 氟苯尼考最大吸收波長為224nm，其他成分在此波長處測定無干擾，用高效液相色譜法（HPLC）測定。色譜條件：Akasil－C18（4．6mm×250mm，5μm），流動相為甲醇－水（40∶60v／v），流速1mL／min，進樣量20μL，柱溫25℃。理論塔板數(shù)按氟苯尼考峰計算應不低于6×103，在該色譜條件下氟苯尼考峰與雜質峰的分離度應符合要求（如圖1）。

圖1 氟苯尼考色譜圖

2．3．1 標準曲線的繪制 氟苯尼考的標準曲線 精密稱取氟苯尼考9．9mg，用甲醇溶解，配成100μg／mL儲備液，分別吸取一定量的儲備液用蒸餾水稀釋至4．95、9．9、19．8、39．6、49．5μg／mL的氟苯尼考標準溶液，10 000r／min離心15min，取上清液按“2．2．2”項下條件進樣檢測。

2．3．2 精密度考察 取質量濃度分別為4．95、19．8、49．5μg／mL氟苯尼考標準溶液，加入酚紅，使其濃度為20μg／mL，分別連續(xù)進樣3次，連續(xù)進樣3d，檢測氟苯尼考的濃度，求得方法的日內(nèi)、日間精密度。

2．4 氟苯尼考飽和溶解度的測定［3－4］分別精密量取蒸餾水、乙醇、丙酮各10mL，置25mL錐形瓶中，平行3份，分別于25℃逐漸加入氟苯尼考至溶液中出現(xiàn)不溶性粉末為止。25℃恒溫振蕩器中強力振蕩（200r／min），48h后取出，取5mL，5 000r／min離心10min，精密量取上清液適量稀釋，參照“2．2．2”項下色譜條件進樣檢測，得氟苯尼考的飽和溶解度；余下飽和溶解度樣品繼續(xù)強力振蕩（200r／min），24h后取出，上述同法測定氟苯尼考的飽和溶解度，對比兩次測定結果的一致性。

2．5 氟苯尼考在大鼠腸內(nèi)吸收試驗 取試驗前禁食12h（自由飲水）的大鼠3只，乙醚麻醉后將其固定于固定臺上，用取暖器保持37℃體溫。沿腹部中線切開腹部（約3cm），在十二指腸上部和回腸下部各切一小口（盡可能避開血管），在十二指腸小口處插入直徑約1cm的塑料管，用棉線扎緊。用蠕動泵將37℃的生理鹽水緩緩注入腸管，洗去腸管內(nèi)容物。洗凈后在回腸下部的小口處插入相同的塑料管，并用棉線扎緊。將腸管兩端的塑料管與蠕動泵相連，形成回路，將腸內(nèi)殘留的生理鹽水盡量流盡后通入循環(huán)液，開始腸循環(huán)?；亓鏖_始后10min，從循環(huán)液中取樣2份樣品，一份1．0mL，另一份0．5 mL，分別作為藥物和酚紅的零點時間樣品。其后每隔10min取相同2份，每次取樣后立即補充1．5 mL酚紅溶液（20μg／mL），取樣至120min后停止回流，取出回流段小腸，測量其面積。

將1mL循環(huán)液樣品10 000r／min離心15min后取上層液進樣檢測，根據(jù)標準曲線計算各個時間點循環(huán)液中藥物濃度。另一份0．5mL循環(huán)液樣品加入5mL 0．2mol／L氫氧化鈉溶液，混勻，10 000 r／min離心15min，取上層液在558nm波長處紫外檢測，計算循環(huán)液中酚紅濃度。通過酚紅濃度校正循環(huán)液體積，計算藥物的剩余量。

3 結果

3．1 酚紅方法考察結果

3．1．1 酚紅標準液在558nm處測定其吸光度A

以吸光度A對分紅濃度C進行線性回歸，得回歸方程：A＝0．016 5C＋0．001 0（R2＝0．999 3），線性范圍為4．95～29．7μg／mL。

3．1．2 由“2．2．2”項下方法測定酚紅回收率 各個濃度的RSD均小于15%，說明酚紅回收率良好，可以滿足測定的要求。

3．2 氟苯尼考方法考察結果

3．2．1 由“2．3”項下色譜條件測定氟苯尼考標準溶液的峰面積。以峰面積Y對濃度C進行線性回歸，得標準曲線，回歸方程：Y＝44．159C＋23．375（R2＝0．999 6），線性范圍為4．95～49．5μg／mL。

3．2．2 由“2．3”項下色譜條件測定氟苯尼考的精密度。氟苯尼考的日內(nèi)、日間精密度分別為5．79%、5．44%，均小于15%，可以滿足測定要求。

3．3 氟苯尼考溶解度 由“2．3”項下色譜條件測定氟苯尼考溶解度，氟苯尼考在蒸餾水、乙醇、丙酮中的飽和溶解度分別為1．224、26．88、78．91mg／mL，在水中的溶解度較低，有機溶劑中溶解度增加。

3．4 氟苯尼考在體腸循環(huán)結果 循環(huán)結束后測得小腸的面積，并根據(jù)剩余量（S）＝St－Wt；Wt＝Ct－1·Vt－1－Ct·Vt；Vt＝［（Vt－1－1．5）·Pt－1＋1．5P］／Pt。

吸收率R＝（初始藥量－120min剩余藥量）／初始藥量×100%；

St－t時間藥物的剩余量；Wt－t時間小腸吸收的藥量；

Ct－t時間循環(huán)液中藥物的濃度，可通過液相色譜法測得；Vt－t時間循環(huán)液體積；

Pt－t時間循環(huán)液中酚紅的濃度，可通過紫外分光光度法測得。

計算結果見表1～3。

以剩余量（S）的對數(shù)對時間t作圖得到1條直線（如圖4），以直線斜率b求出吸收速率常數(shù)：ka＝－2．303×60b，根據(jù)t1／2＝－0．693／ka求出半衰期，根據(jù)吸收率公式求出吸收率，并且根據(jù)小腸面積計算出單位時間單位面積（h·100cm2）的吸收率，結果如表4所示。

表1 低濃度氟苯尼考大鼠腸循環(huán)

表2 中濃度氟苯尼考大鼠腸循環(huán)

表3 高濃度氟苯尼考大鼠腸循環(huán)

由表1～3得氟苯尼考在大鼠腸內(nèi)吸收結果，見表4。

由表4可知，低、中、高濃度大鼠腸吸收的吸收速率常數(shù)分別為0．221h－1、0．221h－1、0．235h－1，半衰期分別為3．135 7h、3．135 7h、2．961 5h，2h吸收率分別為為35．75%、36%、35．56% ，循環(huán)液中藥物濃度下降與循環(huán)時間呈線性，說明氟苯尼考的吸收為一級動力學吸收過程，以被動擴散為主。

圖2 lg（剩余量）與時間t的關系圖

表4 氟苯尼考腸吸收

4 討論

在腸內(nèi)循環(huán)模型廣泛應用于藥物處方前的研究工作，該模型保證了胃腸道神經(jīng)及內(nèi)分泌輸入的完好無損，且血液及淋巴液供應不變，大鼠胃腸道的生理狀況與人相似，因此該模型較好地模擬預測體內(nèi)吸收情況。由于試驗中腸道能吸收或排泄水分，循環(huán)液體積會發(fā)生改變，因此本試驗采用酚紅來標定循環(huán)液體積（酚紅為大分子絡合物，小腸對其基本無吸收）。

本試驗通過對氟苯尼考在不同溶劑中的溶解度測定，可知氟苯尼考水溶性低于脂溶性，推測氟苯尼考溶解度低，生物滲透性差，原料藥的生物利用度可能較低。試驗中建立的大鼠在腸內(nèi)循環(huán)模型對氟苯尼考的吸收作了考察，原料藥吸收率較低，進一步證明氟苯尼考生物利用度低，該藥可能是生物藥劑學中的第三類藥物，即溶解度低，生物滲透性低，可考慮將其制成速釋或長效制劑，有文獻報道將氟苯尼考制成固體分散體［5］、納米粒乳［6］、微球［7］等新型給藥系統(tǒng)，對該藥物的溶解性能和吸收有一定貢獻。本試驗通過對氟苯尼考溶解度及在腸內(nèi)吸收的考察，達到了一定的預期目標，為今后氟苯尼考進一步研究及深層次的推廣做出了一定貢獻。

［1］ Sally－Ann Cryan，Caitriona M．O＇Driscoll．Mechanistic Studies on Nonviral Gene Delivery to the Intestine Using in Vitro Differentiated Cell Culture Models and an in Vivo Rat Intestinal Loop［J］．Pharmaceutical Research，2003，20（4）：569－575．

［2］ G．Briseid，K．Briseid，K．Kirkevold．Increased intestinal absorption in the rat caused by sodium lauryl sulphate，and its possible relation to the cAMP system［J］．Naunyn－Schmiedeberg＇s Archives of Pharmacology，1976，292（2）：137－144．

［3］ Fleming Martínez，Alfredo Gómez．Thermodynamic Study of the Solubility of Some Sulfonamides in Octanol，Water，and the Mutually Saturated Solvents［J］．Journal of Solution Chemistry，2001，30（10）：909－923．

［4］ Chernorukov N G，Nipruk O V，Knyazev A V，etal．State of difficultly soluble uranosilicates MIHSiUO6·nH2O （M＋＝Li＋，Na＋，K＋，Rb＋，Cs＋，NH＋4）in saturated aqueous solutions［J］．Radiochemistry，2004，46（5）：452－456．

［5］ 劉洋，趙修華，祖元剛，等．氟苯尼考PEG 6000固體分散體的無溶劑熔融法制備與分析［J］．中國獸藥雜志，2012，46（4）：40－43．

［6］ 劉安剛，李引乾，孫嬌．氟苯尼考納米乳的制備及品質評價［J］．西北農(nóng)業(yè)學報，2011，20（6）：44－49．

［7］ 李仲謹，田曉靜，楊威．氟苯尼考淀粉微球的制備及緩釋性能的研究［J］．食品工業(yè)科技，2011，2（32）：205－210．