動(dòng)物源性多重耐藥大腸桿菌的分離與鑒定

隋 慧，楊金生

（1．遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州121001；2．吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春130062）

近幾年來(lái)，大腸桿菌病給畜牧業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失日趨嚴(yán)重，致病性大腸桿菌已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)和動(dòng)物醫(yī)學(xué)臨床感染中最常見(jiàn)的病原菌之一。臨床上主要表現(xiàn)為臍炎、關(guān)節(jié)炎、腹膜炎、輸卵管炎、眼球炎、敗血癥。每年死亡的幼豬中約有50%與產(chǎn)毒性大腸桿菌有關(guān)［1］，20世紀(jì)40年代以來(lái)，隨著百余種抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌對(duì)抗菌藥物耐藥已成為當(dāng)今時(shí)代的一個(gè)特征。本試驗(yàn)對(duì)從遼寧省5個(gè)地區(qū)分離出的64株動(dòng)物源性大腸桿菌進(jìn)行了12種抗菌藥物的耐藥性監(jiān)測(cè)與分析，從中選擇多重耐藥大腸桿菌7株供進(jìn)一步研究用。

1 材料與方法

1．1 材料 普通營(yíng)養(yǎng)肉湯、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板、三糖鐵瓊脂斜面、半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂，均按常規(guī)方法自行配制。糖微量發(fā)酵管，由杭州天和微生物試劑有限公司提供。革蘭染色試劑自配。藥敏紙片：氧氟沙星（OFL）、慶大霉素（GM）、鏈霉素（S）、氨芐青霉素（AM）、四環(huán)素（TE）、復(fù)方新諾明（SXT）、環(huán)丙沙星（CIP）、妥布霉素（TM）、壯觀霉素（SPT）、磺胺甲基異口惡唑（SMX）、氟哌酸（NOR）、頭孢氨芐（CX），購(gòu)自衛(wèi)生部抗菌藥物細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)中心。

菌株：大腸桿菌ATCC25922：為大腸桿菌質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)株，購(gòu)自白求恩醫(yī)科大學(xué)細(xì)菌室；H10407：敏感性大腸桿菌，由吉林大學(xué)惠贈(zèng)。病原性大腸桿菌：經(jīng)過(guò)上述鑒定出的于2010年8月至2012年5月從沈陽(yáng)、錦州、葫蘆島、阜新、撫順地區(qū)共分離出64株動(dòng)物病原性大腸桿菌。

氯霉素：購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量為99．5%，批號(hào)：890322。硫酸慶大霉素：煙臺(tái)第二制藥廠生產(chǎn)，干品607μ／mg，批號(hào)：990527。諾氟沙星：浙江新昌制藥股份有限公司，含量為99．17%，批號(hào)：20000306。恩諾沙星：新昌原料藥廠生產(chǎn)純度為97．94%，批號(hào)：20000105。阿莫西林：為河北制藥（集團(tuán)）有限公司，含量為99．36%，批號(hào)：990426。強(qiáng)力霉素：購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量為99．7%，批號(hào)：990319。

1．2 方法

1．2．1 病原性大腸桿菌的分離與鑒定 無(wú)菌操作將患有典型大腸桿菌病癥狀患畜的心、肝、血等病料或以無(wú)菌棉拭子從直腸中采樣，接種伊紅美藍(lán)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)典型菌落接種普通瓊脂培養(yǎng)基和普通肉湯培養(yǎng)基，進(jìn)一步做三糖鐵試驗(yàn)，選擇反應(yīng)模式符合大腸桿菌特征的三糖鐵斜面進(jìn)行涂片、染色、鏡檢。將疑為大腸桿菌的菌落進(jìn)行斜面劃線，冷藏保存，以備進(jìn)行生化鑒定和體外抑菌試驗(yàn)。

將符合三糖鐵斜面反應(yīng)模式的細(xì)菌染色鏡檢為革蘭陰性、兩端鈍圓、大多數(shù)單在的無(wú)芽孢短桿菌，進(jìn)一步進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定，將能夠發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖均產(chǎn)酸產(chǎn)氣，靛基質(zhì)試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，V－P試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)為陰性者鑒定為大腸桿菌。

1．2．2 多重耐藥大腸桿菌的篩選 取鑒定后的純培養(yǎng)物接種于4mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)16h后，取一定量的菌液，按常規(guī)方法進(jìn)行菌液的活菌計(jì)數(shù)，剩余菌液在4℃保存。

采用藥敏紙片法按世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的Kirby－Bauer氏法進(jìn)行。將純培養(yǎng)菌制成懸液，稀釋后菌液濃度為麥?zhǔn)瞎艿?．5號(hào)管（菌液濃度為106～107CFU／mL），均勻涂布0．1mL稀釋后菌液的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上中間鋪放好藥敏紙片，37℃培養(yǎng)16h，測(cè)定抑菌環(huán)直徑，每次設(shè)藥敏質(zhì)控株ATCC25922為對(duì)照菌，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)判定大腸桿菌是否對(duì)抗菌藥物耐藥，從中挑選出多重耐藥大腸桿菌供進(jìn)一步研究用。

采用平皿二倍稀釋法測(cè)定各菌株對(duì)上述6種藥品的最低抑菌濃度（MIC），結(jié)果按美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）的標(biāo)準(zhǔn)判斷。

2 結(jié)果

2．1 鏡檢與生化鑒定結(jié)果 于2010年8月至2012年5月從沈陽(yáng)、錦州、葫蘆島、阜新、撫順地區(qū)共分離出64株動(dòng)物源性大腸桿菌，其中，禽大腸桿菌28株，豬大腸桿菌31株，犬大腸桿菌4株，狐貍大腸桿菌1株。

2．2 64株大腸桿菌的耐藥譜 從遼寧省5個(gè)地區(qū)分離出大腸桿菌64株，經(jīng)對(duì)12種抗菌藥物的耐藥性普查結(jié)果表明（圖1）：64株受檢菌株全部對(duì)一種或多種抗菌藥物有耐藥性，無(wú)一全部敏感株。單耐藥株占1．56%（1／64），2～4耐藥株占9．38%（6／64），5～7耐藥株占15．63%（10／64），8～10耐藥株占12．5%（8／64）。64株大腸桿菌中，共有30種以上的耐藥譜型，大多數(shù)為多重耐藥株，最普遍的耐藥類型是：TE，SXT，SMX、S、AM、CIP、NOR、OFL、GM，它們占受檢菌株的50%。

2．3 64株大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 12種抗菌藥物中，抑菌作用最強(qiáng)的是CX，敏感菌株占81．25%、SPT（78．13%）、TM（67．19%）；而 SMX、SXT、TE等藥物則表現(xiàn)出很高的耐藥性，耐藥菌株分別占SMX（89．06%）、TE（87．5%）、SXT（84．38%）、CB（78．13%）、S（70．31%），此 外，OFL（65．63%）、NOR（62．5%）、CIP（59．38%）、GM（50%）的耐藥株已十分普遍（見(jiàn)表1）。

2．4 隨機(jī)挑選20株大腸桿菌對(duì)6種抗菌藥物的最低抑菌濃度測(cè)定的結(jié)果 臨床分離動(dòng)物源性大腸桿菌對(duì)6種抗菌藥物的耐藥程度十分嚴(yán)重。對(duì)硫酸慶大霉素，最低抑菌濃度為敏感株的10倍以上耐藥株已占58．5%；對(duì)氯霉素、氟哌酸、恩諾沙星、阿莫西林、強(qiáng)力霉素最低抑菌濃度為敏感株的數(shù)十倍的耐藥株分別占32．5%、45．5%、56．5%、62．5%、60．5% 。

圖1 64株動(dòng)物源性大腸桿菌耐藥譜

表1 64株動(dòng)物源性大腸桿菌藥敏試驗(yàn)

2．5 多重耐藥株的篩選 選擇多重耐藥大腸桿菌7株，供進(jìn)一步研究用。選擇的多重耐藥株對(duì)上述6種藥物的最小抑菌濃度（MIC）見(jiàn)表2。其中1號(hào)菌為H10407敏感株，9號(hào)菌為藥敏質(zhì)控株，2，3，號(hào)菌為豬源性大腸桿菌4，5，6號(hào)菌為雞源性大腸桿菌，7號(hào)菌為犬源性大腸桿菌，8號(hào)菌為狐貍源性大腸桿菌。

3 討論

采用kirby－Bauer法，同時(shí)以質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株做對(duì)照，從遼寧省5個(gè)地區(qū)分離的64株大腸桿菌所做的對(duì)12種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，64株大腸桿菌均表現(xiàn)出不同程度的耐藥，在這些耐藥株中，單耐藥株為1株，6耐、7耐、10耐菌株居多，分別為5．87%、7．98%、5．88%，說(shuō)明動(dòng)物源性大腸桿菌的耐藥性以多重耐藥為主，不再停留在對(duì)同一類中數(shù)種抗菌藥物的交叉耐藥。對(duì)隨機(jī)抽取的20株動(dòng)物源性大腸桿菌對(duì)6種抗菌藥物的最低抑菌濃度測(cè)定的結(jié)果表明，耐藥程度已經(jīng)相當(dāng)嚴(yán)重。臨床分離的大腸桿菌對(duì)硫酸慶大霉素、恩諾沙星、阿莫西林、強(qiáng)力霉素的最低抑菌濃度為敏感株數(shù)10倍以上的菌株已超過(guò)半數(shù)。

表2 7株動(dòng)物源性大腸桿菌對(duì)6種抗菌藥物最低抑菌濃度 （MICμg／mL）值

多重耐藥株的大量出現(xiàn)，可能與耐藥性質(zhì)粒［2］、菌體細(xì)胞膜通透性，菌體上存在的主動(dòng)外排系統(tǒng)有關(guān)［3－5］。菌體細(xì)胞膜通透性的改變僅能引起低程度的耐藥，多重耐藥主要與存在于膜上的主動(dòng)外排系統(tǒng)有關(guān)，菌體細(xì)胞膜通透性的改變與主動(dòng)外排系統(tǒng)的超量表達(dá)共同作用可引起細(xì)菌對(duì)多種抗菌藥物高頻率高水平耐藥，耐藥性質(zhì)粒的存在可使多重耐藥水平提高數(shù)倍。大腸桿菌膜上存在Ecr、EmrE、EmrAB、EmrD、QacE、AcrAB、AcrEF等主動(dòng)外排系統(tǒng)。其中染色體DNA上的AcrAB基因編碼的AcrAB蛋白是最主要的主動(dòng)外排系統(tǒng)，可完成多種藥物的外輸，如果使該系統(tǒng)失活，則菌株即從多重耐藥狀態(tài)變?yōu)橄鄬?duì)敏感狀態(tài)。多重耐藥性的產(chǎn)生是由于外輸泵轉(zhuǎn)錄增加或相應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性增加所致。AcrAB基因的轉(zhuǎn)錄水平增加相應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性增加引起的多重耐藥程度和范圍尚待進(jìn)一步研究。

臨床應(yīng)用較多的慶大霉素、鏈霉素、復(fù)方新諾明、氟哌酸等的耐藥株已顯著增加，只有極少使用的頭孢氨芐對(duì)大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)，因而，應(yīng)盡量避免使用臨床應(yīng)用較多的藥物，一方面影響臨床治療效果，另一方面促進(jìn)耐藥因素的擴(kuò)散。

［1］ 王晶鈺，于艷榮，張彥明，等．雞源大腸桿菌某些生物學(xué)特性與致病力相關(guān)特性的研究［J］．中國(guó)家禽，1999，11（6）：5－10．

［2］ 趙靜，楊漢春，查振林．規(guī)?；i場(chǎng)大腸桿菌耐藥性監(jiān)測(cè) ［J］．中國(guó)獸醫(yī)雜志，1998，24（11）：12－13．

［3］ 張小林，李家泰．主動(dòng)外排系統(tǒng)在大腸桿菌中的分布與表達(dá)［J］．中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，1999，15（3）：171－174．

［4］ Martin J，Everett，Yu Fang Jin，etal．J V Piddock Conrtribution of Individual Mechanisms to Fluoroquinolone Resistance in 36Escherichia coli Strains Isolatated from Humans and Animals［J］．Antimicrob Agents Chemother，1996，40：2380－2385．

［5］ John D，Goldman，David G，etal．Multiple Antibiotic Resisrance（mar）Locus Protects Escherichia coli from Rapid Cell Killing by Fluoroquinolones［J］．Antimicrob Agents Chemother，1996．40：1266－1268．