不同穴組電針對(duì)局灶性腦梗死大鼠神經(jīng)行為學(xué)及Neurocan表達(dá)的影響①

鐘藝華，唐顯軍，李光勤，黃浩然

大量臨床研究證實(shí)，中國傳統(tǒng)針刺治療對(duì)腦卒中后的神經(jīng)康復(fù)有著積極的促進(jìn)作用。但不同取穴對(duì)療效的影響有待研究。本研究采用在腦缺血損傷后軸突再生、突觸生長、結(jié)構(gòu)和功能重建等方面起重要抑制作用的神經(jīng)蛋白聚糖neurocan作為觀察指標(biāo)，比較不同經(jīng)絡(luò)屬性穴位的針刺效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠85只，體重200～280 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要儀器及試劑 SDZ-Ⅱ型電子針灸儀：華佗牌，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；RT-PCR技術(shù)盒：TAKARA公司；neurocan一抗：SANTA CRUZ生物技術(shù)公司；生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗：北京中杉金橋生物技術(shù)公司；neurocan SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒：武漢博士德生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 用抽簽法將動(dòng)物分為5組：假手術(shù)組(n=5)、模型組(n=20)、水溝-百會(huì)組(n=20)、肝俞-腎俞組(n=20)和足三里-曲池組(n=20)。其中模型組和各電針組分別根據(jù)缺血時(shí)間(即線栓法阻斷血管至取材的時(shí)間)分為1 d、3 d、7 d、14 d及21 d共5個(gè)亞組，每亞組各4只。

1.2.2 動(dòng)物模型制備及納入標(biāo)準(zhǔn) 參照Longa[1]等的方法，采用線栓法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO)。假手術(shù)組除不插入線栓外，其余步驟相同。參考Longa的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，在大鼠清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。0分：無神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)；1分，神經(jīng)功能輕度缺失：左前肢伸展受限，提尾時(shí)屈曲；2分，神經(jīng)功能中度缺失：爬行時(shí)向癱瘓側(cè)(左側(cè))旋轉(zhuǎn)；3分，神經(jīng)功能重度缺失：爬行時(shí)向癱瘓側(cè)(左側(cè))跌倒；4分：爬行困難，有意識(shí)水平下降的表現(xiàn)。評(píng)分1～3分的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。在術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d和21 d，于大鼠處死前再次進(jìn)行評(píng)分。

1.2.3 穴位選擇 電針組參照華興邦編著的《大鼠穴位圖譜的研制》，根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)，分別取督脈穴水溝、百會(huì)，背俞穴肝俞、腎俞和陽明經(jīng)穴足三里、曲池。水溝：唇裂鼻尖下1 mm正中處，向上刺2 mm；百會(huì)：頂骨正中，向后斜刺2 mm；肝俞(雙)：第9胸椎下兩旁肋間，直刺6 mm；腎俞(雙)：第2腰椎下兩旁，直刺6 mm；足三里(雙)：膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處，直刺7 mm；曲池(雙)：橈骨近端肘關(guān)節(jié)外側(cè)前方凹陷中，直刺4 mm。用30號(hào)1寸毫針刺入穴位，將針柄分別連接在電針儀上，同一輸出電極接同側(cè)兩個(gè)穴位，采用頻率為20～100 Hz的混頻，疏密波，波寬1 ms，刺激強(qiáng)度以大鼠四肢肌肉輕微抖動(dòng)，安靜耐受為度。持續(xù)30 min，每天1次，均在上午10：00進(jìn)行。

1.3 neurocan表達(dá)

1.3.1 mRNA 按照Trizol試劑盒說明書提取缺血腦皮質(zhì)組織中總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈：37℃孵育15 min，85℃5 s終止反應(yīng)，滅活反轉(zhuǎn)錄酶。引物序列：上游引物：5'-GTG TCA TTG CCT GCC TAT CC-3'；下游引物：5'-GTT ATC ACC TCC TGC TCC C-3'(872 bp)。內(nèi)參采用GAPDH，上游：5'-TCA ACG GCA CAG TCA AGG-3'；下游：5'-ACC AGT GGA TGC AGG GAT-3'(470 bp)。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35次循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，運(yùn)用Quantityone凝膠自動(dòng)成像儀成像，以GAPDH為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行質(zhì)控和標(biāo)化，測(cè)定目的條帶neurocan/GAPDH的灰度比值。

1.3.2 蛋白 各時(shí)間點(diǎn)3.5%水合氯醛1 ml/100 g將大鼠深度麻醉，經(jīng)左室灌注生理鹽水200 ml和4%多聚甲醛溶液200 ml進(jìn)行內(nèi)固定。斷頭，取視交叉前后各2 mm腦組織石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片。切片常規(guī)脫蠟、水化，按照試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，DAB顯色，光鏡下細(xì)胞漿和突起中出現(xiàn)粗細(xì)不等的棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。用圖像信號(hào)采集分析系統(tǒng)分別計(jì)數(shù)各亞組梗死灶周邊皮質(zhì)區(qū)陽性細(xì)胞高表達(dá)部位互不重疊的3個(gè)視野(10×40倍)下的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)

假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損癥狀；模型組和各電針組術(shù)后均出現(xiàn)不同程度的進(jìn)食減少，體重下降；Longa評(píng)分為3分的大鼠往往出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡、毛色發(fā)黃等癥狀。各電針組與模型組比較，大鼠運(yùn)動(dòng)功能在缺血3 d后開始逐漸恢復(fù)，7～21 d出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)；水溝-百會(huì)組和肝俞-腎俞組在缺血14 d后Longa評(píng)分低于足三里-曲池組(P＜0.05)。見表1。

2.2 neurocan mRNA

模型組neurocan mRNA在缺血1 d后表達(dá)逐漸增強(qiáng)，14 d達(dá)到峰值，21 d時(shí)有所下降，但仍維持高水平表達(dá)(P＜0.01)。各電針組在缺血3 d后neurocan mRNA表達(dá)均較模型組低(P＜0.05)；并且，水溝-百會(huì)組和肝俞-腎俞組在缺血14 d時(shí)neurocan mRNA表達(dá)較足三里-曲池組低(P＜0.05)。見表2。

2.3 neurocan蛋白

假手術(shù)組未見neurocan陽性細(xì)胞表達(dá)。模型組neurocan蛋白在缺血1 d后表達(dá)明顯增強(qiáng)，胞漿、突起中均可見棕黃色顆粒，14 d達(dá)到高峰(P＜0.01)，21 d時(shí)表達(dá)較高峰有所下降，但仍維持高位表達(dá)。各電針組在缺血3 d后neurocan蛋白表達(dá)均較模型組低(P＜0.05)；其中，水溝-百會(huì)組和肝俞-腎俞組在缺血14 d時(shí)neurocan蛋白表達(dá)較足三里-曲池組低(P＜0.05)。見表3。

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分比較

表2 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)neurocan mRNA表達(dá)比較

表3 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)neurocan蛋白表達(dá)比較

3 討論

研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后，微環(huán)境破壞，能激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和其他膠質(zhì)細(xì)胞，在損傷區(qū)形成膠質(zhì)疤痕組織，阻礙神經(jīng)元再生軸突延伸到遠(yuǎn)側(cè)端，重建特異性的功能聯(lián)系[2]。Neurocan作為與膠質(zhì)疤痕形成密切相關(guān)的分子，是神經(jīng)組織中一種特異性的硫酸軟骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycans,GSPGs)，通過與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)或細(xì)胞表面的黏附分子結(jié)合，掩蓋或改變其靶分子結(jié)構(gòu)，達(dá)到調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞連接、抑制軸突生長的目的。neurocan在突觸可塑性和神經(jīng)修復(fù)過程中發(fā)揮著重要的抑制作用[3-4]。

在左側(cè)感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)輕中度損傷大鼠模型中，Yi等通過免疫印跡和免疫染色發(fā)現(xiàn)，在腦損傷后7 d，neurocan的表達(dá)升高，并一直持續(xù)到損傷后28 d[5]。在大鼠脊髓損傷(SCI)模型中，Andrews等發(fā)現(xiàn)，在損傷平面遠(yuǎn)端的脊髓灰質(zhì)區(qū)，neurocan反應(yīng)性在損傷后7 d明顯升高，到28 d仍維持高水平表達(dá)[6]。本研究顯示，neurocan基因和蛋白表達(dá)規(guī)律一致，均在缺血1 d后表達(dá)逐漸增強(qiáng)，14 d達(dá)峰后逐漸降低，21 d時(shí)仍維持較高水平表達(dá)。與上述研究結(jié)果基本一致。neurocan對(duì)損傷后神經(jīng)元存活和軸突生長的抑制周期較長，這可能是CNS損傷后軸突不能進(jìn)行有效再生，導(dǎo)致機(jī)體的神經(jīng)功能修復(fù)受限的重要機(jī)制之一。

在多種CNS損傷動(dòng)物模型中，阻斷neurocan功能都能促進(jìn)軸突再生和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。neurocan功能主要從以下途徑進(jìn)行阻斷：①抑制neurocan合成：neurocan由核心蛋白和硫酸軟骨素(CS)鏈組成，實(shí)驗(yàn)證明，阻斷核心蛋白或CS鏈與細(xì)胞黏附分子的結(jié)合，能促進(jìn)軸突再生[7-8]；②阻斷糖胺聚糖(GAG)鏈：neurocan通過GAG鏈與核心蛋白結(jié)合發(fā)揮抑制作用，去除GAG鏈能促進(jìn)再生軸突穿過神經(jīng)疤痕組織[9-10]。Hill等在大鼠MACO模型的梗死腔內(nèi)直接注射GSPGs降解酶軟骨素酶ABC連續(xù)7 d，發(fā)現(xiàn)通過酶解neurocan能降低缺血區(qū)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和提高微管相關(guān)蛋白-2(microtubule-associated protein-2,MAP-2)的免疫反應(yīng)性，提高神經(jīng)突延伸，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[11]。Yamaoka等發(fā)現(xiàn)，p38蛋白激酶抑制劑能降低經(jīng)表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中neurocan的過表達(dá)，促進(jìn)脊髓損傷后的軸突再生[12]。Jeong等將肝細(xì)胞生長因子修飾的間質(zhì)干細(xì)胞(HGFMSCs)移植到C4半切損傷的脊髓中，發(fā)現(xiàn)能顯著降低neurocan的表達(dá)和GAG鏈的沉積，促進(jìn)再生軸突穿過膠質(zhì)疤痕和前爪運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[13]。本研究顯示，各電針組在治療3 d后，neurocan mRNA和蛋白表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均較模型組下調(diào)，運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)優(yōu)于模型組，與上述研究發(fā)現(xiàn)符合。提示電針促進(jìn)腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制可能與下調(diào)neurocan有關(guān)，這可能是其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，中風(fēng)病變?cè)谥?jié)，因經(jīng)絡(luò)為邪阻滯，肌肉筋脈失養(yǎng)，導(dǎo)致肢體偏癱。陽明經(jīng)為多氣多血之經(jīng)，足三里、曲池為陽明經(jīng)合穴，針刺該穴位能益氣行血，通經(jīng)活絡(luò)，有助于腦部氣血的恢復(fù)[14]。腦卒中病源在腦，而督脈在循行分布上直接入絡(luò)于腦，具有調(diào)節(jié)全身陽經(jīng)脈氣的作用；因此，臨床上多取具有“醒腦開竅”功效的督脈穴針刺，治療缺血性腦卒中，并觀察到良好的治療效果，且多以水溝、百會(huì)配伍取穴，是針刺促進(jìn)腦缺血損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的常用穴位。此外，也有觀點(diǎn)認(rèn)為肝腎陰虛是中風(fēng)根本的病因病機(jī)，以補(bǔ)益肝腎為法，取背俞穴中的肝俞、腎俞二穴。本研究比較電針不同穴組的效果，結(jié)果顯示，水溝-百會(huì)組和肝俞-腎俞組兩者療效相近[15-16]；在缺血14 d時(shí)，上述兩組取穴的效果優(yōu)于足三里-曲池組。不同經(jīng)絡(luò)屬性穴位的針刺效應(yīng)存在差異，我們考慮與所選擇的穴位分別位于頭部、軀干和四肢，受不同的神經(jīng)節(jié)段支配，其中，督脈取穴和背俞取穴位于腦、脊髓沿線，其刺激信號(hào)在向中樞傳導(dǎo)過程中可能更易影響CNS的活動(dòng)，提示針刺治療中風(fēng)時(shí)存在穴位特異性。

在腦梗死急性期給予穴位電針刺激能下調(diào)neurocan的表達(dá)，這可能是其促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制之一。不同經(jīng)絡(luò)屬性穴位的針刺效應(yīng)存在差異。經(jīng)絡(luò)聯(lián)合取穴是否能取得更好的療效，有待今后進(jìn)一步研究。

[1]Longa EZ,Weistein PR,Calson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1)：84-91.

[2]Busch SA,Silver J.The role of extracellular matrix in CNS regeneration[J].Curr Opin Neurobiol,2007,17(1)：120-127.

[3]Snow DM,Smith JD,Cunningham AT,et al.Neurite elongation on chondroitin sulfate proteoglycans is characterized by axonal fasciculation[J].Exp Neurol,2003,182(2)：310-321.

[4]Zimmermann DR,Dours-Zimmermann MT.Extracellular matrix of the central nervous system：from neglect to challenge[J].Histochem Cell Boil,2008,130(4)：635-653.

[5]Yi JH,Katagiri Y,Susarla B,et al.Alterations in sulfated chondroitin glycosaminoglycans following controlled cortical impact injury in mice[J].J Comp Neurol,2012,520(15)：23205.

[6]Andrews EM,Richards RT,Yin FQ,et al.Alterations in chondroitin sulfate proteoglycan expression occur both at and far from the site of spinal contusion injury[J].Exp Neurol,2012,235(1)：174-187.

[7]Davies JE,Tang X,Denning JW,et al.Decorin suppresses neurocan,brevican,phosphacan and NG2 expression and promotes axon growth across adult rat spinal cord injuries[J].Eur J Neurosci,2004,19(5)：1226-1242.

[8]Moon LD,Asher RA,Rhodes KE,et al.Regeneration of CNS axons back to their target following treatment of adult rat brain with chondroitine ABC[J].Nat Neurosci,2001,4(5)：465-466.

[9]Laabs TL,Wang H.Inhibiting glycosaminoglycan chain polymerization decreases the inhibitory actrocyte-derived chondroitin sulfate proteoglycans[J].J Neurosci,2007,27(52)：14494-14501.

[10]Lin R,Kwok JC,Crespo D,et al.Chondroitinase ABC has a longlasting effect on chondroitin sulphate glycosaminoglycan content in the injured rat brain[J].J Neurochem,2008,104(2)：400-408.

[11]Hill JJ,Jin K,Mao XO,et al.Intracerebral chondroitinase ABC and heparan sulfate proteoglycan glypican improve outcome from chronic stroke in rats[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(23)：9155-9160.

[12]Yamaoka G,Morino T,Morizane K,et al.p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor reduces neurocan production in cultured spinal cord astrocytes[J].Neuroreport,2012,23(9)：546-550.

[13]Jeong SR,Kwon MT,Lee HG,et al.Hepatocyte growth factor reduces astrocytic scar formation and promotes axonal growth beyond glial scars after spinal cord injury[J].Exp Neurol,2012,233(1)：312-322.

[14]霍則軍,張莉,錢瑞琴.針刺不同穴組對(duì)全腦缺血再灌注大鼠TNF-α、IL-6、WBC和自由基的影響[J].針刺研究,2003,(2)：94-98.

[15]Hu R,Yan J,Li TL.Effect of electro-acupuncture of different acupoints on plasma and cerebral Endothelin and CGRP contents in acute cerebral ischemia rats[J].Acupuncture Res,2008,33(3)：169-172.

[16]馬冉冉,李光勤,王進(jìn)平,等.不同穴位電針對(duì)局灶性腦梗死大鼠梗死灶周圍皮質(zhì)GAP-43表達(dá)的影響[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,36(1)：38-41.