發(fā)光二極管紅光對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠血脂的調(diào)節(jié)作用①

盧建麗，劉翠霞，尹昱，安經(jīng)克，賈子善

高脂血癥是臨床上的常見(jiàn)病，多發(fā)病，與心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如何安全有效地降低血脂已成為臨床研究的熱點(diǎn)。有研究表明，低強(qiáng)度激光照射治療可以降低血脂含量[1]，改善血液流變學(xué)[2]。發(fā)光二極管(LED)紅光波長(zhǎng)390～670 nm，與低強(qiáng)度激光的波長(zhǎng)范圍相似，且具有功耗低、易集成、可靠性高、發(fā)光光譜單色性好、波段范圍寬等特點(diǎn)[3]。本科小樣本臨床試驗(yàn)初步顯示，LED紅光在調(diào)節(jié)血脂方面有一定的作用。為此，我們?cè)诮⒋笫蟾咧Y模型的基礎(chǔ)上，觀察LED紅光照射對(duì)高脂血癥大鼠血脂的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)近交系雄性Sprague-Dawley大鼠36只，8周齡，體重218～287 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2006-0009。每籠5只，清潔級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境，溫度18～22℃，濕度50%～60%。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)普通飼料1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=12)和高脂模型組(n=24)。正常對(duì)照組喂普通飼料，高脂模型組喂高脂飼料。高脂飼料喂養(yǎng)6周后，用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，內(nèi)眥靜脈叢取血，分離血清，測(cè)定空腹血清膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL-C)含量。兩組間有非常高度顯著性差異(P＜0.001)，造模成功。見(jiàn)表1。造模成功后再將高脂模型組大鼠隨機(jī)分為高脂對(duì)照組和LED治療組。

表1 高脂飲食6周時(shí)血脂水平(mmol/L)

1.2 高脂飼料配方

2%膽固醇、10%豬油、10%蛋黃粉、0.2%膽酸鈉、77.8%普通飼料按比例計(jì)算出所需量，于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部統(tǒng)一加工而成。普通飼料購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。

1.3 主要試劑及儀器

TC試劑、TG試劑、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL-C)試劑、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL-C)試劑、總酯酶試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號(hào)：201011，201011，2010019，2010028，20110322；兔抗大鼠羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reducase,HMG-CR)多克隆抗體：Santa Cruz公司，批號(hào)：10210；紅光治療儀(PKHGY-Ⅱ型)：河北普康醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.4 LED照射

將LED治療組大鼠放到自制的鼠籠中(120×60×60 mm)，鼠籠置紅光治療儀光頭上，使光頭對(duì)準(zhǔn)大鼠的腹部，每次照射30 min，每天1次，連續(xù)照射28 d。照射期間各組喂養(yǎng)飼料不變。

1.5 血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的測(cè)定

分別于照射前和照射第29天，大鼠禁食12 h后，3%戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射，內(nèi)眥靜脈叢取血，3000 r/min離心10 min，分離血清，用半自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)豪邁)測(cè)定TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量。

1.6 血漿脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)和肝脂酶(hepatic lipase,HL)的測(cè)定

于照射后第29天，大鼠尾靜脈注射肝素130 U/kg[4]，15 min后內(nèi)眥靜脈叢采血，制備血漿。參照改良的Krauss和Blache的方法[5-7]，在37℃、pH=8.3的條件下，將肝素后血漿與底物(脂肪乳劑)一起保溫30 min，血漿中的LPL和HL可將底物中的TG水解為甘油和游離脂肪酸(FFA)。用銅試劑法測(cè)定生成的FFA量，即可分別計(jì)算出LPL和HL的活性。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

于照射后第29天，大鼠禁食12 h，3%戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉，留取所需的血液標(biāo)本后腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，立即取出肝臟，冰生理鹽水漂洗3次，濾紙吸干，在肝臟最大葉距邊緣1 cm處取1×1×1 cm肝組織，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚5 μm。將各組切片置于二甲苯中脫蠟，梯度酒精水化，高壓熱抗原修復(fù)，3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，正常山羊血清封閉非特異性抗原。滴加HMG-CR抗體(1∶75)，4℃冰箱過(guò)夜。用兔抗鼠二抗37℃恒溫孵育60 min，加DBA顯色液，室溫下反應(yīng)，顯微鏡下染色充分，PBS漂洗，蘇木素復(fù)染，梯度酒精逐級(jí)脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。每張切片選取5個(gè)視野，用多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)，在同一光強(qiáng)度、同一放大倍數(shù)下進(jìn)行圖像分析，分別記錄每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)及陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度(5個(gè)視野的均值)，并進(jìn)行總評(píng)分[8]。

陽(yáng) 性 細(xì) 胞 數(shù) 分 級(jí) (A)： 0～1%=0， 1%～10%=1，10%～50%=2，50%～80%=3，80%～100%=4。

陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯色強(qiáng)度分級(jí)(B)：0=陰性，1=弱陽(yáng)性，2=陽(yáng)性，3=強(qiáng)陽(yáng)性。

總評(píng)分(IHS)=A×B

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血清TC、TG、LDL-C和HDL-C

照射前，LED治療組與高脂對(duì)照組血清TC、TG、HDL-C和LDL-C均無(wú)顯著性差異。照射后，與高脂對(duì)照組相比，LED治療組血清TC、TG和LDL-C明顯降低(P＜0.01)，HDL-C 明顯升高(P＜0.01)。見(jiàn)表2、表3。

2.2 血漿LPL、HL活性

照射28 d后，高脂對(duì)照組大鼠血漿LPL、HL的活性低于正常對(duì)照組(P＜0.05)；LED治療組大鼠血漿LPL、HL活性明顯高于高脂對(duì)照組(P＜0.01)；LED治療組大鼠血漿LPL、HL的活性高于正常對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表4。

表2 LED紅光照射前各組血脂水平(mmol/L)

2.3 HMG-CR

HMG-CR陽(yáng)性部位在肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈棕黃色。見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組大鼠肝臟中央靜脈及匯管區(qū)周?chē)梢?jiàn)散在分布的陽(yáng)性細(xì)胞，免疫組化評(píng)分(1.9±0.99)。高脂對(duì)照組大鼠肝臟中央靜脈及匯管區(qū)周?chē)梢?jiàn)較多陽(yáng)性細(xì)胞，免疫組化評(píng)分(3.8±1.99)，高于正常對(duì)照組(t=-2.70,P=0.02)。LED治療組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少，免疫組化評(píng)分(2.1±1.29)，低于高脂對(duì)照組(t=-2.27,P=0.04)。

表3 LED紅光照射后各組血脂水平(mmol/L)

表4 LED紅光照射后各組血漿LPL、HL活性(U/ml)

圖1 各組HMG-CR表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，100×)

3 討論

紅光是指用物理學(xué)方法濾去對(duì)皮膚有損害作用的紫外線和具有明顯熱效應(yīng)的紅外線，僅保留600～700 nm波段的紅光，其主要作用是光化學(xué)作用，而并非熱效應(yīng)。

目前臨床上應(yīng)用的紅光大多為低強(qiáng)度激光。LED紅光作為一種新型的光源，其波長(zhǎng)范圍與低強(qiáng)度激光相同，且具有成本低、節(jié)能、光束面積大等優(yōu)點(diǎn)，正廣泛應(yīng)用于醫(yī)療照明、美容及腫瘤治療等領(lǐng)域，而應(yīng)用LED紅光調(diào)節(jié)血脂的相關(guān)研究，國(guó)內(nèi)外還比較少見(jiàn)。

有研究表明，血漿脂質(zhì)濃度的高低與脂蛋白代謝密切相關(guān)，調(diào)節(jié)影響脂蛋白代謝的酶活性即可調(diào)節(jié)血漿脂質(zhì)濃度[9]。LPL和HL是脂質(zhì)代謝過(guò)程中兩個(gè)關(guān)鍵酶，其缺陷或活性降低，均可導(dǎo)致甘油三酯血癥水平升高。

LPL可以催化乳糜微粒(CM)和極低密度脂蛋白(VLDL-C)核心的TG分解為脂肪酸和單酰甘油酯，以供組織氧化和貯存。同時(shí)還參與VLDL和HDL間的載脂蛋白和磷脂的轉(zhuǎn)換。LPL活性的增強(qiáng)可影響血漿中TG和膽固醇(TC、LDL-C、HDL-C、VLDL-C等)的水平，從而調(diào)節(jié)血漿中脂蛋白的代謝，降低高脂血癥的發(fā)生[10-11]。

HL是血液中內(nèi)源性TG代謝的關(guān)鍵酶之一。研究表明，HL可水解CM、VLDL-C和LDL-C，釋放出FFA[12]，還可以選擇性作用于HDL2，水解其中的甘油三酯和磷脂，有助于肝攝取HDL2中膽固醇及膽固醇酯，在膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用[13]。

LED紅光照射可以增加高脂血癥大鼠血清LPL和HL的活性，可促進(jìn)甘油三酯的水解和膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)血脂的作用。

HMG-CR是膽固醇合成過(guò)程中的限速酶，它存在于胞漿及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。抑制HMG-CR活性，能減少膽固醇合成時(shí)，促使細(xì)胞消耗儲(chǔ)存的膽固醇，進(jìn)而促使肝細(xì)胞增加LDL-C受體的數(shù)量與活性，加強(qiáng)對(duì)血液中LDL-C的攝取利用，從而將低血中總膽固醇及LDL-C，同時(shí)影響其他脂類(lèi)的代謝。

我們推測(cè)，LED紅光照射可能會(huì)抑制肝臟HMG-CR，使血清膽固醇濃度降低。LED紅光如何作用于HMG-CR，機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

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