銀杏葉(舒血寧)聯(lián)合電針對大鼠局灶性腦缺血損傷的保護作用

律泉明 張大威 李一帆 (敦化市醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 敦化 33700)

缺血性腦血管疾病約占腦血管疾病的70% ～85%〔1〕。腦缺血疾病的癥狀體征，在中醫(yī)屬于“中風-中經(jīng)絡(luò)”范疇，其基本病機有風、火、痰、瘀、虛幾端，而無論是何種病理要素為主，均因絡(luò)脈瘀阻，氣血不暢甚或不通而導致腦髓失養(yǎng)、津停血瘀、神機失用〔2〕。美國俄勒岡州立大學醫(yī)學系的研究人員在長達3年多時間的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，65歲以上老年人常年口服銀杏葉制劑可有效預防記憶力退化和阿爾茨海默病〔3〕。研究表明銀杏葉注射液對腦動脈硬化癥引起的腦供血不足有一定的改善作用〔4〕。此外，電針技術(shù)在腦血管疾病的預防和治療方面對改善腦細胞供氧、促進腦細胞功能的恢復都起到了重要的作用。本研究創(chuàng)新性地把我國傳統(tǒng)中醫(yī)中藥理論與電針針灸技術(shù)相結(jié)合，探討此聯(lián)合治療方案對腦缺血損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 72只體重200～250 g雄性健康的Wistar大鼠，由吉林大學白求恩醫(yī)學院實驗動物中心提供。隨機分為四組，每組18只。局灶性腦缺血(MCAO)模型組:給予相同天數(shù)、等體積的生理鹽水，然后做MCAO手術(shù);銀杏葉組:舒血寧注射液(規(guī)格:5 ml/瓶，由北京神威藥業(yè)有限公司提供)，1.25 ml/kg，腹腔注射，1次/d，連續(xù)給藥 7 d，在末次給藥40 min后，做MCAO手術(shù);銀杏葉聯(lián)合電針治療組:在銀杏葉組注射給藥的基礎(chǔ)上，MCAO術(shù)后2 h，進行電針治療，取頭穴和體穴兩組穴位。頭穴:前庭聰、百會、四神聰、水溝穴(取病灶區(qū))，體穴取肢患側(cè):內(nèi)關(guān)、曲池、足三里。選用長25 mm、直徑0.35 mm的毫針，上海產(chǎn)6805-II型治療儀，頻率1～2 Hz，強度0.3～1.0 mA，以針刺處肌肉輕微抖動為宜，持續(xù)15 min，留針15 min。MCAO術(shù)后22 h，重復電針1次。假手術(shù)組:給予相同天數(shù)、等體積的生理鹽水，只分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，不做MCAO手術(shù)。

1.2 大鼠MCAO模型建立 采用改良的Longa方法〔5〕。所有器械經(jīng)高壓蒸汽滅菌，用10%水合氯醛作腹腔麻醉(0.35 ml/100 g)，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，行頸部正中切口，逐層分離并暴露右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈，避免刺激迷走神經(jīng)。在距頸總動脈分叉5 mm處結(jié)扎頸總動脈，剪一“V”形切口，將直徑0.20 mm，長2.5 cm的魚線緩慢插入該口，逐漸插入頸內(nèi)動脈內(nèi)，向前緩慢推進18～19 mm，稍遇阻力即停止，扎緊頸內(nèi)動脈，防止出血和魚線滑出，縫合皮膚。術(shù)后給以軟飼料喂養(yǎng)，飲水不加限制。各組大鼠均MCAO術(shù)后24 h取材。MCAO造模成功的標準:動物手術(shù)清醒后有明顯手術(shù)對側(cè)(即左側(cè))Horner癥(左側(cè)眼瞼下垂，眼球凹陷)及手術(shù)對側(cè)(即左側(cè))偏癱體征(不能完全伸展左前肢，行走時向左側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈)〔6〕。

1.3 腦組織梗死范圍測定〔7〕MCAO造模后24 h，每組6只大鼠，取出腦組織放入低溫生理鹽水中沖洗，隨即放入-20℃冰箱中冷凍5 min，去除嗅球、小腦和低位腦干，冠狀面切成5片，將切片放入4%TTC溶液中，37℃避光孵育30 min后置于50%甲醛溶液中避光保存，固定24 h。經(jīng)TTC染色后，非缺血區(qū)呈玫瑰紅色，梗死區(qū)呈白色。將白色組織仔細切取稱重，以梗死組織占腦組織總重量的百分比作為腦梗死范圍。

1.4 生化指標測定 實驗各組大鼠6只，MCAO造模后24 h，取右側(cè)大腦組織，4℃生理鹽水洗凈，準確稱重后移入玻璃勻漿管中，冰浴條件下，用冷0.9%生理鹽水按1∶10制成10%的腦組織勻漿液，6 000 r/min離心10 min，提取上清，按各試劑盒說明分別進行乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化物(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)的測定。

1.5 電生理檢測 MCAO造模后24 h，每組取6只大鼠，進行感覺誘發(fā)電位(SEP)和運動誘發(fā)電位(MEP)檢測。將受檢大鼠用10%水合氯醛作腹腔麻醉，在頭顱后部，消毒皮膚，切開頭顱后部皮膚，剝離骨膜，用牙科鉆在右側(cè)皮層中央后回感覺區(qū)相對應(yīng)的冠狀縫后3 mm，失狀縫旁1 mm處鉆一盲孔;左腿部剪毛，并暴露左腿坐骨神經(jīng)。用Powerlab誘發(fā)電位儀，BL-410生物機能實驗系統(tǒng)，刺激參數(shù):粗電壓，強度3 V，波寬1 ms，頻率10 Hz，增益20倍，濾波300 Hz，時間常數(shù)0.01 s，掃描速度6.25 ms/div。SEP時，刺激電極位于坐骨神經(jīng)，記錄電極置于皮層，負極置于頭皮下參考電極插于椎旁肌，信號計算機連續(xù)疊加100次，方能記錄到該誘發(fā)電位;檢測MEP時，刺激電極與記錄電極交換，參考電極位于硬腭下。所有大鼠檢測完后測量其潛伏期和峰-峰值，進行統(tǒng)計學分析。

1.6 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進行分析，采用單因素方差分析進行組間比較，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 腦組織梗死范圍 大鼠MCAO術(shù)后24 h，假手術(shù)組未見腦梗死灶，其他各組大鼠均有不同程度的腦梗死灶;銀杏葉聯(lián)合電針組梗死范圍為(5.78±1.63)%;銀杏葉組梗死范圍為(6.86±1.97)%;MCAO對照組梗死范圍為(11.21±2.43)%。其中，銀杏葉組與銀杏葉聯(lián)合電針組梗死灶面積百分比與模型組比較明顯下降(P＜0.05)，銀杏葉聯(lián)合電針組要優(yōu)于銀杏葉組，但統(tǒng)計學上未見顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 各生化指標測定結(jié)果 大鼠MCAO后24 h，與假手術(shù)組相比，其他各組大鼠LDH與SOD活性均降低，以模型組降低最為明顯，銀杏葉聯(lián)合電針組高于銀杏葉組;模型組MDA和NO含量均比假手術(shù)組增高，銀杏葉聯(lián)合電針組數(shù)值增高幅度最小，最接近假手術(shù)組。見表1。

2.3 電生理檢測結(jié)果 模型組已經(jīng)失去正常波形，銀杏葉組和銀杏葉聯(lián)合電針組SEP與MEP的峰-峰值較模型組都有明顯的增加，且潛伏期均有不同程度的縮短，其中銀杏葉聯(lián)合電針組優(yōu)于銀杏葉組。各組之間相比較差異顯著(P＜0.05)。見圖 1，表 2，表 3。

表1 實驗各組大鼠腦組織LDH、SOD、MDA及NO測定結(jié)果(n=6，±s)

表1 實驗各組大鼠腦組織LDH、SOD、MDA及NO測定結(jié)果(n=6，±s)

與模型組比較:1)P＜0.05

組別LDH(U/gpro)SOD(U/mgpro)MDA(nmol/mgpro)NO(μmol/gpro)1.35±0.22 61.94±19.33 6.31±1.02 14.51±1.38銀杏葉組 1.98±0.271)109.75±23.961)4.01±1.111)10.68±1.951)銀杏葉聯(lián)合電針組 2.04±0.211)128.67±24.151)3.39±1.011)9.82±1.931)假手術(shù)組 2.10±0.131)135.54±18.311)3.01±0.861)8.57±1.621)模型組

表2 實驗各組SEP潛伏期與峰-峰值(n=6，±s)

表2 實驗各組SEP潛伏期與峰-峰值(n=6，±s)

與模型組比較:1)P＜0.05;與銀杏葉組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 潛伏期(ms) 峰-峰值(mV)6.34±0.23 0.01±0.01銀杏葉組 5.51±0.301) 0.03±0.011)銀杏葉聯(lián)合電針組 3.82±0.161)2) 0.06±0.011)2)假手術(shù)組 2.07±0.021)2) 0.15±0.011)2)模型組

表3 實驗各組MEP潛伏期(± s，n=6)

表3 實驗各組MEP潛伏期(± s，n=6)

組別 潛伏期(ms) 峰-峰值(mV)6.64±0.41 3.96±1.23銀杏葉組 5.22±0.321) 10.89±2.291)銀杏葉聯(lián)合電針組 4.24±0.141)2) 35.47±1.611)2)假手術(shù)組 2.03±0.021)2) 80.65±0.511)2)模型組

圖1 各組SEP及MEP波形

3 討論

銀杏葉是我國特有植物銀杏樹之葉，性味甘、苦、澀、平，有斂肺、平喘、活血、化瘀、祛風、通絡(luò)、止痛的功效。中醫(yī)認為其具有化痰濕、化淤血、益心肺的作用。目前在臨床上，銀杏提取物及其制劑主要用于治療心腦血管及中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變〔8〕。舒血寧注射液是銀杏葉提取物，主要成分是黃酮和銀杏內(nèi)酯，具有抑制血小板活化因子，清除自由基，促進血液循環(huán);抑制血栓形成，緩解組織缺血缺氧及組織水腫，抗脂過氧化，抑制炎癥反應(yīng)等作用。有研究顯示，早期對腦梗死患者應(yīng)用舒血寧注射液能有效抑制血清可溶性血管細胞黏附分子(sVCAM-1)的表達，從而阻斷白細胞向缺血區(qū)的浸潤和遷移，可減輕缺血腦細胞的損害，有利于病情恢復〔9〕。

針刺可以刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)中內(nèi)啡肽、復合胺、P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽、神經(jīng)肽Y等物質(zhì)的釋放，降低血液黏度，抑制血小板聚集和黏附，抑制紅細胞聚集及降低血球壓積，達到增加腦血流量，改善腦細胞供氧，促進腦細胞恢復功能，激發(fā)和改善腦休克。同時在改善二便功能、緩解肢體痙攣、減輕截癱性疼痛等并發(fā)癥、后遺癥方面有較好的療效〔10〕。

LDH是一種糖酵解酶，在胞質(zhì)內(nèi)含量豐富，當細胞受損或死亡時可釋放到細胞外，所以細胞死亡數(shù)目與LDH活性呈正比，由此可判斷細胞受損的程度。MDA是脂質(zhì)過氧化作用的終產(chǎn)物，在一定程度上間接地反映出細胞損傷的程度。MDA的測定常常與SOD的測定相互配合，SOD活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機體受自由基攻擊的嚴重程度。NO是一種不穩(wěn)定的高度彌散性自由基，主要通過大量的化學反應(yīng)而發(fā)揮其生物學作用，廣泛影響信息傳導過程，能量代謝和DNA合成。在腦缺血損傷時具有雙重作用，多數(shù)研究認為，早期生成的NO由于時間短暫，通過擴張腦血管，增加腦血流，抗血小板聚集及降低細胞內(nèi)鈣等途徑起到對抗缺血性腦損傷的作用;然而在腦缺血中晚期，梗死灶內(nèi)的炎癥細胞、巨噬細胞誘導產(chǎn)生大量誘導型NO合成酶(iNOS)，由此造成NO的過度釋放，起著細胞毒性作用〔11，12〕。本實驗結(jié)果說明銀杏葉聯(lián)合電針能夠抑制腦缺血損傷后的LDH與SOD活性降低，減少細胞死亡數(shù)目，降低細胞損傷的程度，這與各MCAO手術(shù)組腦組織梗死范圍結(jié)果相吻合，銀杏葉聯(lián)合電針同樣能夠抑制MDA和NO含量的增高，減小細胞毒性作用，對腦細胞起到了有效的保護作用。銀杏葉聯(lián)合電針能夠促進腦缺血損傷大鼠感覺功能和運動功能的恢復。

綜上所述，銀杏葉(舒血寧)對腦缺血損傷能起到一定保護作用，但單獨使用效果欠佳。聯(lián)合電針同時應(yīng)用時，對大鼠MCAO損傷具有良好的保護作用，并能有效促進損傷大鼠感覺功能和運動功能的恢復。

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