表淺性膀胱癌細(xì)胞中DNA核酸內(nèi)切酶ERCC1及膜連蛋白-1的表達(dá)及與順鉑耐藥的關(guān)系

關(guān)云哲 楊東彪 王振中 (長(zhǎng)春市中心醫(yī)院泌尿外科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，每年都有大量新增病例出現(xiàn)，近年來(lái)其發(fā)病率在我國(guó)仍呈上升趨勢(shì)〔1，2〕。手術(shù)是膀胱癌治療的關(guān)鍵，而術(shù)后灌注化療可以有效降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，改善患者預(yù)后和提高生存率〔3〕。研究表明，膀胱癌患者的復(fù)發(fā)與膀胱癌治療過(guò)程中出現(xiàn)的耐藥性有關(guān)〔4～7〕。目前，順鉑作為作為一線化療藥物在多種腫瘤中使用，但產(chǎn)生的耐藥性嚴(yán)重影響了其療效。核苷酸切除修復(fù)(NER)是順鉑耐藥的重要機(jī)制之一，而ERCC1是NER途徑的重要因素，在順鉑耐受中起著重要作用〔4〕。膜聯(lián)蛋白-1(Annexin-1)是上皮生長(zhǎng)因子(EGFR)激酶的主要底酶。由于Annexin-1能增強(qiáng)感染局部的凋亡，因此該蛋白質(zhì)與腫瘤細(xì)胞的活性調(diào)節(jié)相關(guān)〔5，6〕。因此，探討ERCC1及Annexin-1對(duì)順鉑耐藥機(jī)制的影響是克服耐藥、提高療效的關(guān)鍵。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌細(xì)胞株 KU7、253JB-V和 T24。順鉑(Cisplatin):長(zhǎng)春市中心醫(yī)院提供。細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM)及胎牛血清:Hyclone(美國(guó));胰酶-EDTA，青、鏈霉素，噻唑藍(lán)(MTT)等:Sigma(美國(guó))。總RNA抽提液TRIZOL:Invitrogen(美國(guó));逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Go-taq DNA聚合酶:Promega(美國(guó));DNA Taq TM Hot Star及DNA marker:TaKaRa(日本)。

1.2 方法

1.2.1 耐藥株細(xì)胞培養(yǎng) 三種人表淺性膀胱癌細(xì)胞用含10%胎牛血清，終濃度為100 U/ml青霉素、鏈霉素的高糖DMEM液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d傳代繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。采用分步誘導(dǎo)法，將KU7、253JB-V和T24細(xì)胞接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組加入低濃度的Cisplatin后，經(jīng)過(guò)大約7 d左右的篩選，細(xì)胞無(wú)因加藥而死亡再逐步提高藥物濃度至0.8 nmol/L(KU7、253JB-V)和0.2 nmol/L(T24)，對(duì)照組加入等量的DMSO培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 選取不同濃度、不同天數(shù)的耐Cisplatin的KU7、253JB-V和T24細(xì)胞，細(xì)胞密度為2×104/ml，種于9 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μl的細(xì)胞液和100 μl的藥物。KU7耐藥株細(xì)胞的Cisplatin藥物濃度(nmol/L)范圍依次為 0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2;253JB-V 耐藥株細(xì)胞的 Cisplatin 藥物濃度(nmol/L)范圍依次為 0、0.2、0.4、0.8、1.6;T24 耐藥株細(xì)胞的Cisplatin藥物濃度(nmol/L)范圍依次為0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6。對(duì)照組加入同等稀釋度的DMSO。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)，24 h換藥，至48 h終止培養(yǎng)前加入 MTT(5 g/L)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后離心，棄上清。加 DMSO 200 μl，避光振蕩15 min，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm處吸光度值，描繪細(xì)胞增殖曲線，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率及藥物的IC50值。

1.2.3 RT-PCR方法檢測(cè)三種細(xì)胞株和其耐Cisplatin的細(xì)胞株的ERCC1及Annexin-1基因的表達(dá) 從細(xì)胞株中提取總的RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。逆轉(zhuǎn)錄PCR條件:42℃ 15 min，90℃ 5 min，4℃停止。PCR 引物:β-actin:前向:5'-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3';反向:5'-AGCTGGCCGGACTCGTCATACT-3';ERCC1:反向:5'-CCAGAGGGCCGGAAGTGAGTC-3';反向:5'-GCACAGGGCACCTCTTCTTCCTC-3';Annexin-1:前向:5'-GACCACCTCAACTCAAGGAC-3';反 向:5'-TCTGAGGTCTTCTCTCTGAAACATC-3';產(chǎn) 物 大 小 分 別 為:621、203、546 bp。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s;53℃復(fù)性40 s;72℃延伸45 s，循環(huán)33次后72℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳(80 V，25 min)，溴乙啶(EB)染色，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，組間樣本均數(shù)比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Cisplatin對(duì)人表淺性膀胱癌細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞殺傷作用 以不同濃度(nmol/L)的Cisplatin作用于KU7、253JB-V和T24 96 h后，隨著Cisplatin藥物濃度的增加，抑制率逐漸增加，IC50分別為:(0.8±0.29)、(0.3±0.09)、(0.2±0.15)nmol/L。

2.2 驗(yàn)證構(gòu)建的耐Cisplatin不同濃度、不同天數(shù)的耐藥株細(xì)胞 MTT結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增加，其KU7+0.4 nmol/L Cisplatin(75 d)耐藥株細(xì)胞和 KU7+0.8 nmol/L Cisplatin(30 d)耐藥株細(xì)胞的 IC50分別為:(1.1±0.3)、(1.25±0.39)nmol/L;253JB-V+0.4 nmol/L Cisplatin(75 d)耐藥株細(xì)胞和253JB-V+0.8 nmol/L Cisplatin(30 d)耐藥株細(xì)胞的IC50分別為:(1.25±0.41)、(1.37±0.36)nmol/L;T24+0.2 nmol/LCisplatin(90 d)耐藥株細(xì)胞的 IC50為:(1.0±0.33)nmol/L。可見(jiàn)隨藥物濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率逐漸增加。

2.3 Cisplatin作用于KU7、253JB-V和T24細(xì)胞及其耐藥株細(xì)胞的ERCC1及Annexin-1基因的表達(dá)狀態(tài) 見(jiàn)圖1。電泳結(jié)果顯示，在 β-actin一致的條件下，與對(duì)照組相比，Cisplatin的KU7、253JB-V細(xì)胞ERCC1基因表達(dá)水平明顯增多，而Annexin-1基因無(wú)明顯變化。對(duì)照組的T24細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組 T24 0.2 nmol/L(Cisplatin 90 d)耐藥株細(xì)胞中ERCC1及Annexin-1基因均沒(méi)有明顯的變化。

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，同時(shí)也是人類(lèi)腫瘤中最具侵襲性的腫瘤，在西方國(guó)家僅次于前列腺癌。早期手術(shù)是膀胱癌患者治療的關(guān)鍵，術(shù)后5年內(nèi)有20% ～80%的患者復(fù)發(fā)，這與新發(fā)腫瘤、腫瘤細(xì)胞種植或原發(fā)腫瘤切除不完全有關(guān)〔5～8〕。研究表明，膀胱癌患者的復(fù)發(fā)除存在腫瘤復(fù)發(fā)的高危因素(瘤體大小、數(shù)目、腫瘤的復(fù)發(fā)頻率、病理分級(jí)等)外，還與治療過(guò)程中出現(xiàn)的藥物耐藥性有關(guān)〔9，10〕。

NER是Cisplatin耐藥的重要機(jī)制之一〔11〕。NER是一個(gè)循環(huán)的過(guò)程，其中DNA損傷識(shí)別/切除通路作用機(jī)制復(fù)雜。ERCC1基因是一種高度保守的DNA核酸內(nèi)切酶，其產(chǎn)物與DNA修復(fù)酶缺乏互補(bǔ)基因形成緊密的異二聚體(ERCC1-XPF)，在NER中起到調(diào)節(jié)的重要作用〔12，13〕。而 Annexin-1基因能促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)程，這也表明其對(duì)腫瘤的診斷和治療有重要意義，因此說(shuō)明Annexin-1基因與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔14，15〕。

本研究說(shuō)明在膀胱癌中ERCC1基因表達(dá)因人而異，相對(duì)低表達(dá)的患者對(duì)Cisplatin敏感;而在T24耐藥株中，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其表達(dá)變化，這可能與細(xì)胞中P53基因突變或個(gè)體基因表達(dá)差異有關(guān)〔16〕，當(dāng)然這需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。盡管Annexin-1基因在膀胱癌治療中對(duì)Cisplatin引起細(xì)胞凋亡有調(diào)解作用，但是在三種膀胱癌耐藥株中表達(dá)均無(wú)明顯變化，也可能在這三種細(xì)胞系中，Annexin-1基因不能正常積累mRNA，當(dāng)然這還需要大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

目前腫瘤的治療還在探索中，任何單一的手段都難以達(dá)到真正的治愈。因此，膀胱癌應(yīng)采用手術(shù)聯(lián)合多種藥物綜合的治療，并根據(jù)患者不同的基因型來(lái)做出相關(guān)的治療方案。所以，制訂出個(gè)體化的理想治療模式將有助于指導(dǎo)臨床工作，提高膀胱癌整體的治療水平。

圖1 KU7、253JB-V和T24在Cisplatin作用下ERCC1及Annexin-1基因的表達(dá)水平

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