Mda7基因增強(qiáng)放射線抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)的作用

殷振娥 何淑梅 劉永哲 金順子 吳叢梅 (長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 300)

目前，在我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率正呈逐年上升趨勢(shì)，尤其是中老年患者比例增長(zhǎng)較快。傳統(tǒng)的治療方法都具有局限性，嚴(yán)重影響了治療效果和患者的生活質(zhì)量〔1，2〕。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，將基因治療作為傳統(tǒng)治療方法的輔助手段，集兩種治療方法的優(yōu)點(diǎn)，避免各自的局限性，是目前研究前列腺癌治療方法的主要方向之一。放射治療是治療前列腺的重要手段之一〔3〕，但是由于其能對(duì)腫瘤鄰近部位的正常組織造成損傷，而且很多前列腺癌類型具有輻射抗性，使放射治療前列腺癌的療效和應(yīng)用受到限制〔4，5〕。研究證實(shí)，白細(xì)胞介素-24(IL-24)基因可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常組織卻沒有損傷，同時(shí)可以提高機(jī)體的免疫功能，是一種理想的腫瘤治療基因〔6～8〕。因此就將IL-24基因作為放療的輔助基因，通過提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，來增強(qiáng)前列腺癌的放療效果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) 人類前列腺癌細(xì)胞系PC-3，來自于中國(guó)長(zhǎng)春吉林大學(xué)，用含10%胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)(GIBCO-BRL;Grand Island，NY，USA)。

1.2 質(zhì)粒 pcDNA-Mda7質(zhì)粒由吳叢梅博士構(gòu)建。即將Mda7 cDNA插入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒中，然后將pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和pcDNA-Mda7質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體lipofectamine(GIBCO-BRL;USA)包裹轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。

1.3 方法

1.3.1 集落形成分析 PC-3細(xì)胞接種在6孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)中，24 h后，培養(yǎng)基換成無血清DMEM培養(yǎng)基，并將pcDNA-Mda7質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。6 h后，培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染8 h后，胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)。將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞重新接種到90-mm的培養(yǎng)皿(Nunc，Roskilde，Denmark)中，繼續(xù)孵育到肉眼可見的集落，14 d后計(jì)數(shù)這些集落，并計(jì)算出集落形成百分比。

1.3.2 細(xì)胞凋亡測(cè)定 放射誘導(dǎo)凋亡實(shí)驗(yàn)中，PC-3細(xì)胞接種到 12 孔板內(nèi)，24 h 后給予不同劑量 X-射線(0，2，5，10，20 Gy)照射。X-射線照射24 h后，PC-3細(xì)胞系經(jīng)碘化丙啶(PI)染色，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化?；蛘T導(dǎo)凋亡實(shí)驗(yàn)中PC-3細(xì)胞接種12孔板，24 h后，經(jīng)脂質(zhì)體包裹，將pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pcDNA-Mda 7質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到PC-3細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。24 h染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化。聯(lián)合誘導(dǎo)凋亡實(shí)驗(yàn)中，PC-3細(xì)胞接種于12孔板，分別給予不同的處理:(1)轉(zhuǎn)染組，于接種24 h后，細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcD-NA-Mda 7質(zhì)粒;(2)照射組，于拉種32 h后，細(xì)胞分別給予2和8 Gy的X-射線照射;(3)聯(lián)合應(yīng)用組，于接種24 h后，細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA-Mda 7質(zhì)粒，于接種32 h后，分別給予2和8 Gy和X-射線輻射。于接種38 h后，各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化。對(duì)照組沒有經(jīng)過轉(zhuǎn)染或照射處理。

1.4 X-射線照射 X-射線照射機(jī)(Model X.S.S.205 FZ;吉林大學(xué))，劑量率為 0.287 Gy/min，200 kV，10 mA，0.5 mm Cu/0.5 mm Al的過濾器。源物距56 cm。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料以±s表示，組間比較采用χ2和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 輻射誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡 X-射線輻射誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞細(xì)胞凋亡呈劑量隨照射劑量升高而增加。2 Gy和5 Gy X-射線可以誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡〔(7.04±1.41)%、(8.24±0.33)%〕，但與0 Gy對(duì)照組相比沒有顯著性差別〔(6.15±0.24)%〕。10 Gy和 20 Gy X-射線照射后，PC-3細(xì)胞凋亡率明顯增加〔(8.74±0.35)%，(20.78±1.95)%，P＜0.01〕，是 0 Gy對(duì)照組的1.58～3.38倍。

2.2 Mda7誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡 與空白對(duì)照組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的細(xì)胞相比，pcDNA-Mda7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他兩組(P＜0.001)。因此表明，pcDNA-Mda7質(zhì)粒能夠在PC-3細(xì)胞中正常表達(dá)，并誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡。

2.3 Mda7抑制PC-3細(xì)胞集落形成 PC-3細(xì)胞接種6孔板，將pcDNA3.1(+)質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pcDNA-Mda7質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到PC-3細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。采用集落形成法檢測(cè)Mda7抑制PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。(A)正常細(xì)胞對(duì)照組，細(xì)胞集落形成最多;(B)pcDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，細(xì)胞集落形成比正常細(xì)胞對(duì)照組多;(C)pcDNA-Mda7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，細(xì)胞集落形成最少。計(jì)數(shù)集落形成數(shù)并統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，pcDNAMda7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞集落形成數(shù)量最低，為(620±18)個(gè)，明顯低于正常細(xì)胞對(duì)照組〔(1 288±141)個(gè)，P＜0.001〕和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組〔(1 104±107)個(gè)，P＜0.001〕，約為正常對(duì)照組的0.5倍。見圖1。

圖1 PC-3細(xì)胞集落形成

2.4 X-射線聯(lián)合pcDNA-Mda7誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組相比，單純pcDNA-Mda7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率是(9.64±0.69)%，單純8 Gy的 X-射線照射組細(xì)胞凋亡率是(7.67±1.23)%，這兩組明顯高于對(duì)照組〔(4.98±0.16)%，P＜0.01〕;而單純2 Gy X-射線照射組細(xì)胞凋亡率是(6.35±0.31)%與對(duì)照組相比沒有明顯變化;在聯(lián)合應(yīng)用組中，轉(zhuǎn)染了pcDNA-Mda7質(zhì)粒的PC-3細(xì)胞并分別給予2 Gy和8 Gy X射線照射，細(xì)胞凋亡率分別為(12.74±2.68)%和(18.39±0.17)%明顯高于對(duì)照組和2、8 Gy單純X-射線照射組和單純轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)。

3 討論

多種前列腺癌對(duì)輻射的抗性使這種惡性疾病的臨床治療方法受到限制，也影響了治療結(jié)果，有研究報(bào)道，Mda7基因可以抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)〔8，9〕，也可以增強(qiáng)某些腫瘤細(xì)胞的放射敏感性〔6〕。

在本研究中，選擇前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3，首先檢測(cè)其輻射敏感性，結(jié)果證實(shí)PC-3細(xì)胞具有輻射抗性;同時(shí)Mda7基因可以用來抑制PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)，但是，由于分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展有限，作為單獨(dú)的基因治療，受到安全性和有效性的限制。2 Gy照射與pcDNA-Mda7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染聯(lián)合應(yīng)用，可以顯著提高細(xì)胞凋亡率。此結(jié)果說明，聯(lián)合應(yīng)用可以達(dá)到提高腫瘤治療效果和減輕對(duì)正常組織損傷的目的。本研究結(jié)果初步確定了聯(lián)合應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)，為下一步的機(jī)制研究和應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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