種植材料表面飛秒激光摻銀改性的抗菌性

王 瑞 周延民 (吉林大學(xué)口腔醫(yī)院預(yù)防口腔科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

近年來，越來越多的人采用種植牙技術(shù)修復(fù)缺失牙，而導(dǎo)致種植失敗的原因多是由于種植體周圍感染。通過在種植體表面修飾抗菌劑或制備功能性涂層作為抗菌元素的載體等方法可降低種植體周圍感染的發(fā)生率，但存在操作復(fù)雜、涂層易脫落、抗菌性不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。本研究擬采用簡(jiǎn)單有效的方法提高種植材料抗菌性能，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 牙齦卟啉單胞菌P.g由吉林大學(xué)口腔醫(yī)院生物實(shí)驗(yàn)室提供，鈦合金Ti-6Al-4V圓片(陜西寶鈦集團(tuán))，鈦:藍(lán)寶石飛秒激光放大器(Solstice，美國(guó) spectra-physics公司)，掃描電子顯微鏡(JSM-6700F，日本JEOL電子公司)，熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)，超凈工作臺(tái)(蘇州空氣儀器廠)，厭氧培養(yǎng)箱(義烏冷凍廠產(chǎn)DY-1型)。

1.2 材料的制備及表征 實(shí)驗(yàn)所用鈦片為直徑8 mm，厚度1 mm的圓片。在激光作用之前，樣品經(jīng)過拋光處理，依次用丙酮、乙醇、去離子水清洗，然后利用真空鍍膜儀在樣品表面蒸鍍一定厚度的金屬銀，隨后將清洗后的鈦片表面用鈦:藍(lán)寶石飛秒激光放大器進(jìn)行處理，脈沖寬度為100飛秒，中心波長(zhǎng)為800 nm，重復(fù)頻率為1 kHz，通過焦距為180 mm的凸透鏡將激光聚焦在樣品上，能量密度分別為1.4 J/cm2，掃描速度為1 mm/s，激光處理后的樣品依次用丙酮、乙醇和去離子水中超聲處理。飛秒激光摻雜金屬銀的含量隨蒸鍍銀的厚度增加而增加。樣品分為7組，依激光蒸鍍銀厚度分別命名為Ag-Ti-0 nm，Ag-Ti-25 nm，Ag-Ti-100 nm，Ag-Ti-200 nm，Ag-Ti-300 nm，Ag-Ti-400 nm和Ag-Ti-500 nm組。

1.3 牙齦卟啉單胞菌的復(fù)蘇與培養(yǎng) 選擇P.g模式株ATCC33277作為實(shí)驗(yàn)菌株。復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)菌凍干株接種于腦心浸液-輔助培養(yǎng)基(BHI-S)血瓊脂平板上，在37℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)(80%N2、10%CO2、10%H2)72 h，Gram 染色檢查為純培養(yǎng)物，接種于BHI-血瓊脂平板上厭氧培養(yǎng)48 h，經(jīng)鑒定后的培養(yǎng)物用pH7.2的0.2 mmol/ml磷酸鹽緩沖液配成細(xì)菌懸液(1×109CFU/ml)備用。

1.4 抑菌試驗(yàn) 將P.g懸液(1×109CFU/ml)以BHI液體培養(yǎng)基稀釋成1×106CFU/ml的菌懸液。將鈦片置于75%的酒精中浸泡30 min后，經(jīng)紫外線消毒1 h。無菌48孔反應(yīng)板中分別放入各實(shí)驗(yàn)組鈦片，每孔中各加入稀釋后的菌懸液1 ml，放入37℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。將48孔板中的各組鈦片取出，將48孔反應(yīng)板中的液體充分震蕩均勻并稀釋。分別取100 μl各樣本的稀釋液用L棒涂布于新鮮配制的BHI-S瓊脂板上，37℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5天，觀察培養(yǎng)基表面的菌落形態(tài)并計(jì)數(shù)。

1.5 細(xì)菌增殖率的檢測(cè) 將各實(shí)驗(yàn)組鈦片在75%酒精中浸泡30 min后，在超凈臺(tái)內(nèi)將各實(shí)驗(yàn)組鈦片用紫外燈正反兩面各照射30 min。將P.g懸液(1×109CFU/ml)以BHI液體培養(yǎng)基稀釋成1×106CFU/ml的菌懸液。把實(shí)驗(yàn)組的鈦片分別放入消毒高壓過得離心管內(nèi)，然后分別每個(gè)離心管中加入10 ml 1×106CFU/ml菌懸液，37℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別在1、3、5、7 d時(shí)，用紫外分光光度儀波長(zhǎng)600 nm處測(cè)吸光度值(A值)，并記錄。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 P.g菌落的形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)數(shù)結(jié)果 對(duì)照組和Ag-Ti-0 nm組形成的菌落呈圓形，數(shù)量多，分別為1 772、1 748，，遍布于培養(yǎng)基的表面，菌落的形態(tài)較小;Ag-Ti-25 nm、Ag-Ti-100 nm、Ag-Ti-200 nm、Ag-Ti-300 nm組，菌落的數(shù)量隨著蒸鍍銀層的厚度增加而逐漸減少，分別為900、640、588、228，單個(gè)菌落的形態(tài)逐漸增大;Ag-Ti-400 nm組菌落的數(shù)量(156)較前幾組明顯減少;在Ag-Ti-500 nm組幾乎沒有肉眼可見的菌落。見圖1。

2.2 飛秒激光摻銀改性后對(duì)P.g生長(zhǎng)的影響 在1、3、5、7 d時(shí)，各組的A值均隨著摻銀層厚度的增加而逐漸降低，說明抗菌能力隨著摻銀量的增加而增強(qiáng)。在1 d時(shí)，各組之間的A值無統(tǒng)計(jì)差異;在3、5、7 d時(shí)，差異顯著，Ag-Ti-500 nm組A值均顯著低于其他各組(P＜0.05)，說明Ag-Ti-500 nm組的抗菌能力更強(qiáng)。在3 d時(shí)各組的A值均低于1 d時(shí)各組的A值，但在5、7 d時(shí)A值逐漸增高。見表1。

圖1 不同實(shí)驗(yàn)組形成的牙齦卟啉單胞菌的菌落形態(tài)及數(shù)量

表1 各組1、3、5、7 d A 值

3 討論

骨整合的概念首先由Br?nemark提出，對(duì)于種植體的長(zhǎng)期成功很重要。但細(xì)菌的存在可能使整合的過程復(fù)雜化，細(xì)菌很容易在種植體的表面黏附和增殖，導(dǎo)致種植體因感染而失敗。通過在術(shù)前調(diào)整種植體表面的抗菌性，術(shù)后感染可以被克服。

通過表面形貌的改變可以調(diào)節(jié)細(xì)菌的黏附，Whitehead等〔2〕研究了細(xì)菌在有0.5～2 μm直徑凹坑材料表面的黏附，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在相對(duì)粗糙表面的黏附增多。而Hilbert等〔3，4〕的研究結(jié)果表明，粗糙度的變化并沒有對(duì)細(xì)菌黏附、增殖和分化有任何影響，細(xì)菌附著力不與表面粗糙度的增加有關(guān)。另一種抑制細(xì)菌黏附的方法是用高度水和分子修飾表面。最常用的親水涂料是乙二醇或聚環(huán)氧乙烷〔5，6〕，然而，這種親水表面也抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞的黏附〔7〕。除了抗黏附聚合物，殺菌化合物被用來改性植入表面以減少感染的風(fēng)險(xiǎn)，如慶大霉素〔8〕、殼聚糖〔9〕。最近，銀被用于各種醫(yī)療應(yīng)用中〔10，11〕。將銀摻雜在某些材料中在種植材料的表面制作成復(fù)合材料涂層，如與羥基磷灰石摻雜通過電化學(xué)沉積在鈦表面形成帶有抗菌性的生物活性表面〔12〕。

本研究采用電子蒸鍍的方式在種植材料表面形成不同厚度的銀蒸鍍層，然后采用飛秒激光處理有蒸鍍層的表面，在激光熔融材料表面形成微米-納米復(fù)合結(jié)構(gòu)的同時(shí)將銀摻雜在表面改性層中，形成穩(wěn)定的摻銀微米納米復(fù)合層，并對(duì)不同厚度摻銀激光改性鈦表面的抗菌性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)隨著摻銀層厚度的增加培養(yǎng)基表面的菌落數(shù)逐漸減少，到一定厚度時(shí)菌落消失，說明摻銀改性表面有抗菌性，隨著摻銀量的增加抗菌性逐漸增強(qiáng)。此研究結(jié)果在其他學(xué)者的研究中得到證實(shí)〔13〕，并認(rèn)為銀能引起細(xì)菌失活，主要是通過銀離子黏附到微生物的DNA，防止細(xì)菌繁殖。

本實(shí)驗(yàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，銀離子濃度的下降和細(xì)菌的耐受力增強(qiáng)而出現(xiàn)細(xì)菌增殖，但其增殖能力隨著摻銀量的增加而降低。本實(shí)驗(yàn)只是進(jìn)行了抗菌性的體外實(shí)驗(yàn)部分，發(fā)生在體內(nèi)的復(fù)雜的過程不可能完全被體外研究所復(fù)制，還需進(jìn)行相關(guān)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其應(yīng)用價(jià)值。

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