低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)立體培養(yǎng)的人退變髓核細(xì)胞的影響

張曉軍 胡偵明 郝 杰 沈皆亮 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，重慶 400016)

椎間盤退變(IDD)是引起椎間盤源性疾病的主要原因。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)IDD的本質(zhì)是椎間盤發(fā)生細(xì)胞學(xué)和生物學(xué)的變化，椎間盤細(xì)胞的數(shù)量和生物活性下降，椎間盤內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成的減少和降解的增加〔1，2〕。因此找到某種方法來(lái)增加椎間盤細(xì)胞的數(shù)目和活性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，恢復(fù)椎間盤的生物活性，是可能修復(fù)椎間盤退變的有效手段。低強(qiáng)度脈沖超聲(LIPUS)目前作為一種促進(jìn)骨折愈合的物理治療方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床，大量研究證明LIPUS不僅可以促進(jìn)骨折愈合，而且還對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)分泌具有一定的調(diào)節(jié)作用〔3〕。椎間盤細(xì)胞與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在基因表達(dá)和功能方面具有高度同源性。本研究通過(guò)觀察低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)退變椎間盤髓核細(xì)胞的作用，以期探索一種能修復(fù)椎間盤退變的方法，并能用于臨床上治療因椎間盤退變引起的椎間盤源性疾病。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 椎間盤髓核組織來(lái)源于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院脊柱外科住院患者腰后路減壓術(shù)中切除的髓核，均獲得患者知情同意，并通過(guò)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。退變的椎間盤髓核組織來(lái)源于16例病人，年齡60～72歲(男7例，女9例)，所取椎間盤退變程度根據(jù)脊柱MRI Pfirrmann分級(jí)〔4〕分為GradeⅢ～Ⅵ。

1.2 主要儀器 低強(qiáng)度脈沖超聲儀由重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 主要試劑 DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基 (Hyclone，美國(guó))，胎牛血清 (Hyclone，美國(guó))，Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶(Sigma，美國(guó));鼠單抗 COLA2α1抗體(Santa Cruz，美國(guó))，鼠單抗 aggrecan抗體(Santa Cruz，美國(guó));兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體、S-P試劑盒、DAB顯色試劑盒 (博士德，武漢)。RNA抽提試劑盒(Invitrogen，USA)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，大連)，熒光定量 PCR反應(yīng)試劑盒(TaKaRa，大連)。

1.4 方法

1.4.1 髓核細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

1.4.1.1 髓核細(xì)胞的分離培養(yǎng) 術(shù)中所取的椎間盤標(biāo)本，置入預(yù)先準(zhǔn)備好的內(nèi)含少量DMEM/F12(Hyclone，美國(guó))培養(yǎng)基的無(wú)菌培養(yǎng)皿并置入冰盒內(nèi)迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。按照文獻(xiàn)〔5〕的方法，稍加改進(jìn)。在超凈臺(tái)內(nèi)將所取椎間盤組織用眼科剪和眼科鑷小心去除軟骨終板和纖維環(huán)組織，并用PBS緩沖液清洗3遍，去除血污。將髓核組織剪碎至1 mm3大小，置于0.25%的胰酶中，37℃恒溫水浴20 min，每5 min搖勻一次，以利于充分消化。加入適量含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，離心(800 r/min，5 min)，棄上清，PBS液沖洗洗、離心2遍，加入0.2%Ⅱ型膠原酶37℃水浴消化3～4 h至組織塊基本消失。200目不銹鋼細(xì)胞篩過(guò)濾，離心(800 r/min，5 min)，去除上清液，加入適量PBS液沖洗、離心2遍。用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基吹打混勻細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)，按1.0×105/ml細(xì)胞密度種植于25 cm2培養(yǎng)瓶，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.1.2 免疫組化鑒定 取P2代髓核細(xì)胞爬片，取出經(jīng)PBS。液洗后，用4%多聚甲醛固定30 min，3%H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水洗滌(5 min×3次)。滴加5%BSA封閉液阻斷，室溫20 min，去除多余液體，加入適當(dāng)濃度COLA II(1∶200)一抗，4℃冰箱過(guò)夜。室溫平衡后，PBS洗滌(5 min×3次)，加入生物素標(biāo)記二抗(1∶400)，37℃ 30 min，PBS液沖洗(5 min×3次)。滴加試劑SABC，室溫孵育30 min，PBS液沖洗(5 min×3次)。顯色劑DAB顯色，蒸餾水洗滌，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、常規(guī)封片。陰性對(duì)照以一抗稀釋液代替一抗。

1.4.2 髓核細(xì)胞三維立體培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)〔6〕并稍加改進(jìn)，選擇P3代細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板進(jìn)行三維立體培養(yǎng)。取適量P3代細(xì)胞懸液與1.2%的藻酸鈉溶液混勻，通過(guò)22號(hào)針頭逐滴加入各孔預(yù)先置入100 mmol/L氯化鈣溶液的6孔板，形成直徑約為2 mm大小的藻酸鈣凝珠，靜置10 min。吸走剩下的氯化鈣溶液，用生理鹽水洗滌藻酸鈣凝珠3次，再用DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌3次。最后每孔加入4 ml含青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml和20%FBS的 DMEM/F12培養(yǎng)液，置 37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d換液。

1.4.3 LIPUS作用于三維立體培養(yǎng)髓核細(xì)胞 細(xì)胞轉(zhuǎn)至6孔板內(nèi)三維立體 24 h后 開(kāi) 始 不 同 強(qiáng) 度(0、15、30、60、120 mW/cm2)的超聲刺激(20 min/d)，總共1 w。在超聲儀的6孔板支架臺(tái)上涂抹專用超聲藕合膠，使6孔板底部緊貼于支架臺(tái)上的超聲探頭，開(kāi)始不同強(qiáng)度的超聲刺激。對(duì)照組(0 mW/cm2)同條件置于支架臺(tái)上20 min，不予超聲刺激。低強(qiáng)度脈沖超聲波頻率為1.5 MHz，脈沖頻率為1 kHz，超聲波作用時(shí)間為200 μs，間隙時(shí)間為 800 μs。

1.4.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 選取超聲波強(qiáng)度為0、15、30、60、120 mW/cm2分別作用于三維立體培養(yǎng)的髓核細(xì)胞1 w后，用濃度為50 mmol/L的檸檬酸鈉溶液溶解藻酸鈣凝珠，使包埋在其中的髓核細(xì)胞游離出來(lái)。收集細(xì)胞后用PBS洗2次，將細(xì)胞重懸結(jié)合緩沖液，加入Annexin V-FITC和PI進(jìn)行標(biāo)記后用FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))檢測(cè)凋亡率。

1.4.5 RT-PCR檢測(cè) 根據(jù)1.4.4結(jié)果，選擇超聲波強(qiáng)度為30、60、120 mW/cm2作用下的游離髓核細(xì)胞。收集細(xì)胞提取RNA，檢測(cè)aggrecan和Ⅱ型膠原的mRNA表達(dá)水平。按RNA抽提試劑盒RNAiso Plus說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptR RT reagent Kit With gDNA Eraser將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)使用SYBRR Green Realtime PCR Master Mix試劑。反應(yīng)體系按說(shuō)明書執(zhí)行，iQ5定量PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))上機(jī)檢測(cè)。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性2 min，95℃變性5 s，各自的退火溫度30 s，72℃延伸30 s，共35循環(huán)。引物序列:COL2 α1 上游:5'-CAGGTGAACCTGGACGAGAG-3'，下游5'-CCCACAGCACCAGTCTCAC-3';聚集蛋白聚糖(aggrecan):上游:5'-GGAATGATGTTCCCTGCAAT-3'，下游:5'-GTCTGCGTTTGTAGGTGGTG-3';GAPDH:上游:5'-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3'，下游:5'-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3'。以上引物均由生工生物工程公司(上海)合成。結(jié)果采用2-ΔΔCt法行相對(duì)定量解析。

1.4.6 Western印跡檢測(cè) 選擇1.4.5相同的游離髓核細(xì)胞，收集細(xì)胞提取總蛋白，檢測(cè)aggrecan和Ⅱ型膠原的蛋白表達(dá)水平。用預(yù)冷的PBS液洗滌細(xì)胞3次，加入預(yù)冷的RIPA裂解液冰上反應(yīng)30 min，4℃下13 000 g/min離心5 min，收集上清液即為蛋白質(zhì)粗提物。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取等量蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST液洗滌(15 min×4次);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST液洗滌(15 min×3次)，ECL顯色。常規(guī)壓片，顯影，照相，Quantity One軟件分析各條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，數(shù)據(jù)顯著性檢驗(yàn)用Dunnett-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下細(xì)胞形態(tài) 細(xì)胞5～7 d開(kāi)始爬壁生長(zhǎng)，形態(tài)呈短梭形、多角形;9～14 d能爬滿培養(yǎng)瓶90%，呈鋪路石樣或蜂窩狀生長(zhǎng)，可傳第一代(P1);3 w左右能傳第二代(P2)。見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞鏡下觀察

2.2 免疫組化鑒定結(jié)果 見(jiàn)圖2。

圖2 免疫組化可見(jiàn)髓核細(xì)胞胞質(zhì)著色呈棕黃色

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡 結(jié)果顯示予以超聲強(qiáng)度為30、60、120 mW/cm2的 LIPUS 刺激細(xì)胞后，30、60、120 mW/cm2組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯降低，15 mW/cm2與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異 (見(jiàn)圖3)。

圖3 不同超聲強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

2.4 RT-PCR檢測(cè)aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)水平 結(jié)果顯示予以超聲強(qiáng)度為30、60、120 mW/cm2的LIPUS刺激細(xì)胞后，aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高，組間比較無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖4)。

2.5 Western印跡檢測(cè)aggrecan和Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示予以超聲強(qiáng)度為30、60、120 mW/cm2的LIPUS刺激細(xì)胞后，aggrecan和Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組(0 mW/cm2)顯著升高，組間比較亦無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖5)。

圖4 Aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA水平表達(dá)結(jié)果

圖5 Aggrecan和Ⅱ型膠原蛋白水平表達(dá)結(jié)果

3 討論

椎間盤退變涉及髓核、纖維環(huán)及軟骨終板，但顯著的改變還是發(fā)生在髓核，如細(xì)胞外基質(zhì)成分合成減少、降解增多，基質(zhì)水合作用降低，而負(fù)責(zé)基質(zhì)合成的髓核細(xì)胞的凋亡，在這個(gè)病變過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用〔7〕。因此，通過(guò)抑制髓核細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)髓核基質(zhì)的合成，是可能延緩或修復(fù)椎間盤退變的途徑。

椎間盤髓核細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)已非常成熟，既往對(duì)體外細(xì)胞的相關(guān)研究多采用單層培養(yǎng)，而大多細(xì)胞體外單層培養(yǎng)一定時(shí)間后細(xì)胞會(huì)發(fā)生去分化現(xiàn)象，尤其是髓核細(xì)胞，傳至3～5代后細(xì)胞便開(kāi)始向纖維細(xì)胞分化，增殖能力下降，而藻酸鈣凝膠三維立體培養(yǎng)能夠很好地保持細(xì)胞原有表型〔8〕。本研究對(duì)退變椎間盤髓核細(xì)胞采用藻酸鈣凝珠三維立體培養(yǎng)，更好地模擬體內(nèi)環(huán)境，使髓核細(xì)胞保持圓球形，自身所分泌Ⅱ型膠原、蛋白多糖被局限在細(xì)胞的周圍，使得細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的密切關(guān)系得到了保持，更有利于細(xì)胞存活、增殖和合成細(xì)胞外基質(zhì)。因?yàn)樵逅徕}在交聯(lián)過(guò)程中，凝膠內(nèi)形成通向表面的放射狀管道，增加了藻酸鈣凝膠的表面積，提供了細(xì)胞需要的營(yíng)養(yǎng)和代謝產(chǎn)物的交換渠道〔9〕。

超聲波主要有三大效應(yīng):空泡效應(yīng)、熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)。低強(qiáng)度脈沖超聲不用于高強(qiáng)度聚焦超聲對(duì)組織和細(xì)胞的殺死作用，其致熱效應(yīng)很微弱，對(duì)細(xì)胞主要產(chǎn)生促進(jìn)增殖和合成相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)。低強(qiáng)度脈沖超聲在促進(jìn)骨折愈合方面的確切療效〔10〕，使得其獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)越來(lái)越被重視，將其用于軟骨等其他軟組織方面的研究越來(lái)越多〔11，12〕，但其在椎間盤退變方面的研究報(bào)道較少。Iwashina等〔13〕發(fā)現(xiàn)LIPUS對(duì)體外培養(yǎng)的兔正常椎間盤細(xì)胞增殖和細(xì)胞ECM(主要是蛋白多糖)的合成有促進(jìn)作用。Kobayashi報(bào)道〔14〕LIPUS可以促進(jìn)人髓核細(xì)胞株合成蛋白多糖和 BMP2、FGF7、TGFβR1、VEGF等生長(zhǎng)因子及相關(guān)受體的表達(dá)。

本研究說(shuō)明一定超聲強(qiáng)度的LIPUS有抑制體外三維立體培養(yǎng)的細(xì)胞凋亡的作用。LIPUS有促進(jìn)退變髓核細(xì)胞合成Ⅱ型膠原和蛋白多糖的作用。推測(cè)其機(jī)制可能為L(zhǎng)IPUS通過(guò)其機(jī)械效應(yīng)對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生一種微應(yīng)力，使信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生一些列生物學(xué)效應(yīng)，亦或通過(guò)縫隙連接促進(jìn)細(xì)胞間的信息傳遞而產(chǎn)生效應(yīng)〔15〕。但組間比較差異無(wú)顯著性，提示LIPUS對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)合成的促進(jìn)作用在一定范圍內(nèi)無(wú)明顯劑量依賴性。

1 Loreto C，Musumeci G，Castorina A，et al.Degenerative disc disease of herniated intervertebral discs is associated with extracellular matrix remodeling，vimentin-positive cells and cell death〔J〕.Ann Anat，2011;193(2):156-62.

2 Le Maitre CL，Pockert A，Buttle DJ，et al.Matrix synthesis and degradation in human intervertebral disc degeneration〔J〕.Biochem Soc Trans，2007;35(Pt 4):652-5.

3 Vaughan NM，Grainger J，Bader DL，et al.The potential of pulsed low intensity ultrasound to stimulate chondrocytes matrix synthesis in agarose and monolayer cultures〔J〕.Med Biol Eng Comput，2010;48(12):1215-22.

4 Griffith JF，Wang YX，Antonio GE，et al.Modified Pfirrmann grading system for lumbar intervertebral disc degeneration〔J〕.Spine，2007;32(24):E708-12.

5 Ciapetti G，Granchi D，Devescovi V，et al.Ex vivo observation of human intervertebral disc tissue and cells isolated from degenerated intervertebral discs〔J〕.Eur Spine J，2012;21(1):S10-9.

6 Stephan S，Johnson WE，Roberts S.The influence of nutrient supply and cell density on the growth and survival of intervertebral disc cells in 3D culture〔J〕.Eur Cell Mater，2011;22:97-108.

7 Singh K，Masuda K，Thonar EJ，et al.Age-related changes in the extracellular matrix of nucleus pulposus and anulus fibrosus of human intervertebral disc〔J〕.Spine，2009;34(1):10-6.

8 Darling EM，Athanasiou KA.Rapid phenotypic changes in passaged articular chondrocyte subpopulations〔J〕.J Orthop Res，2005;23(2):425-32.

9 Lin YJ，Yen CN，Hu YC，et al.Chondrocytes culture in three-dimensional porous alginate scaffolds enhanced cell proliferation，matrix synthesis and gene expression〔J〕.J Biomed Mater Res A，2009;88(1):23-33.

10 Pounder NM，Harrison AJ.Low intensity pulsed ultrasound for fracture healing:a review of the clinical evidence and the associated biological mechanism of action〔J〕.Ultrasonics，2008;48:330-8.

11 Naito K，Watari T，Muta T，et al.Low-intensity pulsed ultrasound(LIPUS)increases the articular cartilage type II collagen in a rat osteoarthritis model〔J〕.J Orthopaedic Res，2009;28(3):361-9.

12 Anil K，Richard TC.N.The effects of LIPUS on soft-tissue healing:a review of literature〔J〕.British Medical Bulletin，2009;89:169-82.

13 Iwashina T，Mochida J，Miyazaki T，et al.Lowintensity pulsed ultrasound stimulates cell proliferation and proteoglycan production in rabbit intervertebral disc cells cultured in alginate〔J〕.Biomaterials，2006;27:354-61.

14 Kobayashi Y，Sakail D，Iwashina T，et al.Low intensity pulsed ultrasound stimulates cell proliferation，proteoglycan synthesis and expression of growth factors related genes in human nucleus pulposus cell line〔J〕.Eur Cells Materials，2009;17:15-22.

15 Kotaro S，Siddhesh RA，Arihiko K.Low-intensity pulsed ultrasound and cell-to-cell communication in bone marrow stromal cells〔J〕.Ultrasonics，2011;51:639-44.