牛Fas相關(guān)死亡功能域蛋白（FADD）研究進(jìn)展

張文剛，楊潤軍

（吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062）

Fas相關(guān)死亡功能域蛋白最早是在酵母雙雜交系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種具有與Fas死亡域和TNFR－1死亡域高度同源域的蛋白，并很快被證明是Fas受體和TNFR－1受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號銜接蛋白［1］。近年來隨著對FADD進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADD在細(xì)胞內(nèi)能與很多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)蛋白作用，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、胚胎發(fā)育、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生等生物學(xué)活動。本文從FADD基因結(jié)構(gòu)、蛋白修飾、參與信號途徑及其不同的生物學(xué)作用進(jìn)行系統(tǒng)闡明和論述。

1 牛FADD基因及蛋白的結(jié)構(gòu)

牛的FADD基因位于29號染色體，基因全長2406kb，編碼區(qū)包含兩個外顯子，即長度為288bp編碼死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（Death Effector Domain，DED）的外顯子Ⅰ和長度為342bp編碼死亡結(jié)構(gòu)域（Death Domain，DD）的外顯子Ⅱ。研究發(fā)現(xiàn)其上共有7個單核苷酸突變位點。

不同物種間FADD基因結(jié)構(gòu)、基因序列之間存在一定差異（表1）。FADD蛋白一級結(jié)構(gòu)既存在差異，又具有許多保守氨基酸位點。同源性分析結(jié)果顯示，牛與野豬FADD序列同源性高達(dá)87%、與人類為82%。因此，顯示出這些氨基酸位點對FADD發(fā)揮功能起重要作用。通過核磁共振等生物化學(xué)方法分析FADD結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADD的DD和DED分別由6個α螺旋組成，并成尾連尾的正交垂直結(jié)構(gòu)［3］。此外，DED 包含前體caspase－8和前體caspase－10結(jié)合位點。

2 FADD蛋白質(zhì)修飾

2.1 FADD的泛素化修飾

近年來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADD存在泛素化修飾，即蛋白酶對FADD進(jìn)行特異性剪切，使FADD在其參與的細(xì)胞凋亡或增殖途徑中發(fā)揮相應(yīng)作用。目前，已發(fā)現(xiàn)有兩種蛋白酶對FADD具有泛素化修飾的能力，即顆粒酶 M（GzmM）和 Makorin環(huán)指蛋白1（MKRN1）。

GzmM是誘導(dǎo)caspase途徑和細(xì)胞色素c介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中重要的蛋白酶，研究結(jié)果顯示，GzmM在自然殺傷細(xì)胞中特異性的在196號位蛋氨酸以后剪切形成tFADD，使得自身寡聚化能力提高，進(jìn)而促進(jìn)前體caspase－8聚集、加工，及一系列的級聯(lián)反應(yīng)［4］。

實驗證明，Makorin環(huán)指蛋白1（Makorin RingFinger Protein 1，MKRN1）對細(xì)胞內(nèi)FADD蛋白進(jìn)行泛素化修飾，使FADD失去信號銜接作用。將MKRN1基因敲除可以使FADD在細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并迅速合成大量死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體（death－inducing signaling complex，DSIC），從而激活了胞外途徑的細(xì)胞凋亡。

表1 不同物種FADD基因、mRNA和外顯子長度

2.2 FADD的磷酸化修飾

磷酸化作為FADD的主要修飾方式，是保證FADD發(fā)揮多種生物學(xué)功能的重要前提。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化FADD在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)行等過程中起著重要作用［5，6］。一般哺乳動物FADD磷酸化氨基酸位點為Ser－194，除此之外還存在Ser－187和Ser－203位點（見圖1）。實驗證明，酪蛋白激酶1α（casein kinase 1α，CK1α）能使FADD Ser－194磷酸化，并能形成FADD－CK1α復(fù)合體，在細(xì)胞有絲分裂中期將磷酸化FADD定位于紡錘絲兩極，參與有絲分裂的進(jìn)行。當(dāng)小鼠脾細(xì)胞缺乏CK1α，磷酸化FADD數(shù)量明顯減低，并且細(xì)胞有絲分裂受到抑制作用［7］。

Polo樣激酶1（polo－like kinase 1，PLK1）是細(xì)胞在有絲分裂G2期和M期形成中心體、紡錘體兩極的關(guān)鍵蛋白。實驗證明，利用紫杉醇處理過的細(xì)胞，只有在FADD Ser－203位點被 Aur－A 磷酸化前提下，PLK1才能將 FADD Ser－187磷酸化［8］，磷酸化FADD蛋白又負(fù)反饋作用于PLK1，并且具有抑制腫瘤增殖、提供細(xì)胞死亡潛在可能等作用［9］。

(3)鉀化：為礦區(qū)最早的蝕變，以形成大面積的面狀鉀長石為特征，蝕變后巖石整體呈肉紅色，主要礦物為鉀長石，少量石英和絹云母及條帶狀黃鐵礦，鉀長石呈細(xì)脈或粒(斑)狀分布于礦體和蝕變圍巖中，因受擠壓而破碎，被絹云母化交代、疊加而呈港灣狀，可見硅質(zhì)細(xì)脈及黃鐵礦細(xì)脈穿插其中。

隨著更多FADD磷酸化激酶被發(fā)現(xiàn)和磷酸化FADD作用機制被闡明，F(xiàn)ADD生物學(xué)功能被深刻的了解。有人指出在一些粘附細(xì)胞株中，F(xiàn)ADD聚集于細(xì)胞核，F(xiàn)ADD Ser－194磷酸化后才能從胞核轉(zhuǎn)移至胞漿。胞質(zhì)內(nèi)FADD的定位，依賴于磷酸化FADD與核漿穿梭蛋白exportin－5的相互作用。所以說磷酸化FADD是調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡平衡的關(guān)鍵蛋白［6］，磷酸化和非磷酸化FADD之間的平衡，是細(xì)胞保持內(nèi)穩(wěn)定的重要前提。磷酸化FADD在細(xì)胞中作用的分子機制，為腫瘤疾病的治療提供了新的思路。但磷酸化FADD亞細(xì)胞定位［6］以及磷酸化和非磷酸化FADD平衡調(diào)控機制有待進(jìn)一步研究。

3 FADD生物學(xué)功能

3.1 FADD參與細(xì)胞凋亡

程序性死亡（PCD）即細(xì)胞凋亡，對于多細(xì)胞生物的正常發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要，在組織分化、器官發(fā)育、機體穩(wěn)態(tài)的維持中具有重要意義。凋亡是指細(xì)胞的形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，伴隨細(xì)胞收縮、細(xì)胞膜破裂、染色體凝縮等形態(tài)學(xué)改變。與之對應(yīng)是壞死，通常指細(xì)胞在受毒素刺激后細(xì)胞逐漸破裂溶解的過程。目前已知的三種主要凋亡途徑包括：細(xì)胞膜上死亡受體（DRs）途徑，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑、線粒體凋亡途徑。

腫瘤壞死因子受體家族成員在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中各自起著不同作用。目前已知19個死亡受體中主要有：腫瘤壞死因子（TNFR－1）、CD40L、CD27L、Fas等。FADD主要參與Fas／Fa sL途徑和TNFR－1途徑細(xì)胞凋亡，是信號傳遞中的銜接蛋白。但有研究發(fā)現(xiàn)FADD也是TRAIL途徑細(xì)胞凋亡的銜接蛋白［10］。

圖1 人類、小鼠、大鼠、黑猩猩、松鼠猴、綠狒狒、雞、牛、斑馬魚FADD核酸保守序列分析

3.1.1 FADD參與Fas／FasL途徑細(xì)胞凋亡 Fas基因位于牛26號染色體長臂（26q13），基因編碼產(chǎn)物為45KD I型跨膜蛋白，主要分布于胸腺細(xì)胞、外周活化T、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和部分組織細(xì)胞。Fas配體（Fas Ligand，F(xiàn)asL）是40KD II型跨膜蛋白，主要表達(dá)并存在于T、B淋巴細(xì)胞表面，亦可被釋放至胞外形成可溶性功能活性分子［11，12］。Fas／FasL途徑誘導(dǎo)免疫細(xì)胞、生殖組織細(xì)胞等多數(shù)細(xì)胞凋亡，在維持組織正常發(fā)育、控制免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)機體生理平衡中起重要作用。

FADD參與Fas／FasL途徑細(xì)胞凋亡過程是：表面存在Fas蛋白受體的細(xì)胞與FasL結(jié)合，形成三聚體并在細(xì)胞內(nèi)開始募集FADD，即Fas細(xì)胞內(nèi)的DD與FADD的DD高度同源并反向平行連接。一旦FADD被激活，F(xiàn)ADD的DED會與細(xì)胞內(nèi)游離前體caspase－8或少數(shù)前體caspase－10的DED結(jié)合，至此以上蛋白（Fas的 DD、FADD、procaspase－8，－10）形成的三聚體被稱為DISC（見圖2）。

前體caspase－8和前體caspase－10經(jīng)過修飾形成caspase－8和caspase－10，會在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列的caspase級聯(lián)反應(yīng)［13，14］，進(jìn)而細(xì)胞發(fā)生凋亡。但胞內(nèi)游離的c－FLIP（cellular FLICE－inhibitor protein）的DED也與FADD的DED存在高度同源性，因此會和前體caspase－8競爭結(jié)合，抑制細(xì)胞凋亡［15，16］（見圖3）。

圖2 Fas／FasL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中，三種復(fù)合體組成及功能

研究發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)內(nèi)脫離Fas后的FADD與前體caspase－8、c－FLIP共同形成的復(fù)合體具有放大通路凋亡信號作用［13］，作用機制有待進(jìn)一步的研究。

3.1.2 FADD參與 TNF－R1途徑細(xì)胞凋亡 牛TNF基因位于22號染色體長臂（22q23），編碼蛋白為234個氨基酸單位II型跨膜蛋白。表達(dá)于包括淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多數(shù)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞受到脂多糖、細(xì)菌毒素或白介素的刺激時，會大量表達(dá)。皮膚受到損傷出現(xiàn)炎癥時，肥大細(xì)胞大量分泌前體TNF。TNF－R1途徑細(xì)胞凋亡在先天免疫、炎癥發(fā)生、抗腫瘤細(xì)胞等中起重要作用。

圖3 FADD參與Fas／Fasl誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

TNF－R1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分為兩個步驟：首先，細(xì)胞膜上受體蛋白TNF－R1在外源因子TNFα的刺激，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)會募集形成TNF－R1－TRADDTRAF2－RIP復(fù)合體，激活 NF－κB細(xì)胞存活信號。在細(xì)胞執(zhí)行完生命活動后，進(jìn)行第二個步奏，上述復(fù)合體從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)脫落，在胞質(zhì)內(nèi)形成TRADDTRAF2－RIP－FADD－Procaspase－8，－10復(fù)合體［13，17］。前體caspase－8和前體caspase－10經(jīng)過修飾形成caspase－8和caspase－10之后會在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列的caspase級聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞發(fā)生凋亡。

3.1.3 FADD參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑細(xì)胞凋亡 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是細(xì)胞抵抗不良外界刺激的重要機制，也是應(yīng)激損傷細(xì)胞的重要機制［18］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能激活細(xì)胞保護(hù)機制，目前發(fā)現(xiàn)同型半胱氨酸、氧化應(yīng)激、鈣離子代謝紊亂等都能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激級聯(lián)反應(yīng)［19］。但應(yīng)激過度時，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。實驗證明，F(xiàn)ADD參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑細(xì)胞凋亡。在衣霉素作用下FADD被募集至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與RTN3相互作用，激活FADD依賴型caspase－8、－9級聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡。與此同時，Bid被切割引起細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，也能引起細(xì)胞凋亡［20］。由此可以看出FADD參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑的細(xì)胞凋亡，與線粒體途徑細(xì)胞凋亡也存在聯(lián)系。

3.2 FADD與T淋巴細(xì)胞增殖

除了介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生理功能外，F(xiàn)ADD在T淋巴細(xì)胞增殖中起著重要作用［21］。實驗證明，F(xiàn)ADD隱性突變小鼠T淋巴細(xì)胞由于凋亡而活性受到抑制［22］。又有實驗證明5周大FADD基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，胸腺細(xì)胞CD4＋CD8＋量顯著減少，并且T淋巴細(xì)胞有絲分裂過程受到抑制［13］。

FADD S－191被天冬氨酸取代后得到的轉(zhuǎn)基因小鼠FADD（S191D），其FADD蛋白處于一種模擬的永久磷酸化狀態(tài)。這樣的小鼠其發(fā)育過程不正常，表現(xiàn)出了和免疫系統(tǒng)FADD缺失的小鼠相似的表型，小鼠能存活但表現(xiàn)出貧血和脾大，只有很少的CD4＋CD8＋胸腺細(xì)胞，而其免疫系統(tǒng)發(fā)育方面的問題也暗示了增殖的缺陷。

有研究證明，在T細(xì)胞中條件性敲除caspase－8顯示出與FADD相似的T細(xì)胞增殖缺陷。T細(xì)胞條件性敲除c－FLIP也能導(dǎo)致相似的T細(xì)胞增殖缺陷。因此，F(xiàn)ADD、caspase－8和c－FLIP不僅協(xié)同參與細(xì)胞凋亡，同時也參與促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖過程。所以，有待于進(jìn)一步的實驗證明依賴FADD途徑T細(xì)胞增殖的分子機制，才能全面的了解FADD的生理功能。

3.3 FADD與組織融合及胚胎發(fā)育

在胚胎發(fā)育過程中，組織融合對個體生物器官的形成，如：神經(jīng)管、上顎、眼裂等起著重要作用。組織融合相關(guān)調(diào)控基因如果發(fā)生缺失或突變，就會引起先天畸形等癥狀。

研究表明，在FADD缺失的發(fā)育胚胎中，細(xì)胞表現(xiàn)為增殖能力增強、RIP1／RIP3調(diào)控的程序性壞死途徑激活、發(fā)育過程中出現(xiàn)眼裂無法閉合的現(xiàn)象。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADD基因的表達(dá)受細(xì)胞內(nèi)Pax2因子和Vax2因子的調(diào)控。通過對大鼠FADD基因編碼區(qū)上游序列分析，發(fā)現(xiàn)了兩個Pax2因子結(jié)合位點（位于－381、－158）和一個Vax2蛋白因子的結(jié)合位點（位于－246）。野生型發(fā)育胚胎在發(fā)育過程中，Pax2因子與Vax2因子會結(jié)合到FADD基因調(diào)控區(qū)的相關(guān)位點，使FADD基因進(jìn)行正常轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，保證了胚胎組織眼部發(fā)育融合的正常發(fā)生。如果胚胎細(xì)胞中Pax2或Vax2缺失，會導(dǎo)致FADD表達(dá)量不足，引起RIP1／RIP3介導(dǎo)的程序性壞死途徑激活，眼裂無法正常閉合。因此以上事實說明FADD是Pax2與Vax2的下游目的基因，是調(diào)控眼部組織融合的分子開關(guān)［23］。又已知FADD－caspase－cFLIP復(fù)合體在胚胎發(fā)育過程中，阻止RIP3介導(dǎo)的程序性細(xì)胞凋亡［24］，故推斷此為FADD阻止眼裂非正常融合的分子機制。

上述事實說明FADD參與胚胎發(fā)育過程中的組織融合，又有實驗證實FADD基因缺失的小鼠胚胎在形成后11.5d 就會死亡［25］，且該過程與caspase－8，－10無關(guān)，由此推測在胚胎發(fā)育過程中FADD不僅參與凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，同樣參與非凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

3.4 FADD與炎癥發(fā)生

炎癥是血管組織對有害刺激如：病原體、受損細(xì)胞、刺激物等的一種防御性反應(yīng)，并通過除去有害刺激和啟動愈合程序，使生物體受到保護(hù)的一種機制。通常情況下，炎癥是有益的，是人體的自動的防御反應(yīng)，但是有的時候，炎癥也是有害的，例如對人體自身組織的攻擊、發(fā)生在透明組織的炎癥等等。

炎癥的發(fā)生主要是通過三個不同信號通路：JAK－STAT、MAPK、NF－κB［26］。其中，F(xiàn)ADD 對NF－κB途徑的炎癥發(fā)生具有抑制和促進(jìn)兩種相反作用。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，NF－κB通路的形成需要細(xì)胞膜表面的受體激活，這些受體包括：Toll樣受體4（Toll－like receptor 4，TLR4）、白介素1受體（interleukin 1receptor，IL－1R）。在熱休克蛋白60（HSP60）、纖連蛋白 A（Fibonectin A）、透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid）等作用下，激活 TLR4受體；在白介素1β作用下，激活I(lǐng)L－1R受體。隨著上述受體的激活，細(xì)胞內(nèi)MyD88蛋白與IRAK蛋白結(jié)合，標(biāo)志著NF－κB途徑炎癥發(fā)生，分泌白介素1、白介素6、白介素8、TNFα等。當(dāng)細(xì)胞中存在FADD蛋白時會與IRAK競爭結(jié)合MyD88，從而抑制炎癥的發(fā)生。

圖4 FADD已知生物學(xué)功能

但FADD蛋白在TNF－R1和Fas介導(dǎo)的NF－κB途徑中同樣起著關(guān)鍵作用［13，27］。實驗證明，TNF－α是重要的促炎因子，在缺失FADD蛋白細(xì)胞中TNFR1和Fas介導(dǎo)的NF－κB途徑受到徹底抑制。并且Fas－FADD復(fù)合體過表達(dá)會引起細(xì)胞調(diào)亡和炎癥的發(fā)生。

FADD除了參與上述兩種炎癥發(fā)生途徑外，在RIP3介導(dǎo)的細(xì)胞壞死途徑而引發(fā)的慢性腸炎中起抑制作用［28，29］。以上事實證明FADD蛋白在炎癥發(fā)生過程中存在于多種途徑，并扮演不同的角色。現(xiàn)已明確部分細(xì)胞只存在某一種通路，不同通路間存在相互作用，但機體如何協(xié)調(diào)FADD在各通路中的作用機制目前尚不明確。所以，亟待實驗進(jìn)一步證明。

4 展望

在科技水平日益發(fā)達(dá)的今天，各種新技術(shù)手段對FADD蛋白的深入研究起到了積極作用。通過10年左右的研究，不斷地發(fā)現(xiàn)FADD如何作為一個多功能蛋白在基因?qū)用?、蛋白質(zhì)層面對機體生理功能的影響。圖4描述的是以FADD為中心的相關(guān)生物學(xué)功能。從圖中可以看出FADD有關(guān)的生物學(xué)功能并非孤立存在，而是具有內(nèi)在聯(lián)系。不同種類細(xì)胞、不同發(fā)育階段細(xì)胞、不同外界刺激等這些變量是FADD在細(xì)胞中具有不同生物學(xué)功能、介導(dǎo)不同信號通路的根本原因。盡管國內(nèi)外研究者對FADD的了解日漸加深，但關(guān)于牛FADD基因的相關(guān)報道不多見。能否將候選基因FADD作為肉牛肉質(zhì)和胴體性狀遺傳標(biāo)記還是一個亟待解決的問題。

焦裴等曾提出FADD上游蛋白FAS基因型可能與肉牛肉質(zhì)和胴體相關(guān)，因此在今后的研究中根據(jù)FADD基因的多態(tài)性來判斷其基因型，找出各種基因型與肉牛肉質(zhì)和胴體之間的相關(guān)性從而將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用到育種和生產(chǎn)中去。

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