三七總皂苷對肺纖維化小鼠細(xì)胞凋亡及Bax／Bcl－2表達(dá)的影響＊

孫曉芳，段 斐△，牛建昭，黨志勇，楊慧慈

（1.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組胚教研室 071000；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組胚教研室 100029；3.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院辦公室 071000；4.河北省保定市第二醫(yī)院兒科 071000）

肺纖維化是以上皮細(xì)胞損傷、基膜脫落、成纖維細(xì)胞增殖、間質(zhì)炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積為主要特點(diǎn)的肺部疾病，近年來大量研究顯示成纖維細(xì)胞增殖與纖維化形成可以獨(dú)立于炎癥而發(fā)生，因此提示肺纖維化肯定存在細(xì)胞凋亡與增殖的失衡［1］。在細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中受許多因子的參與調(diào)控，其中Bax／Bcl－2是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子，他們的表達(dá)與肺纖維化肺組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［2－3］。

前期研究表明，PNS可降低肺纖維化小鼠血清中Ⅲ－C、Ⅳ－C型膠原、層粘連蛋白（laminin，LN）及透明質(zhì)酸（hyaluronan，HA）的含量，降低肺纖維化小鼠肺組織羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）的含量，減輕肺組織膠原的增生，對BLM誘導(dǎo)的肺纖維化起到一定的防治作用［4－5］。本研究在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，觀察三七總皂苷（PNS）對肺纖維化小鼠肺組織細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bax／Bcl－2表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其防治肺纖維化的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 選取健康清潔級C57BL／6雄性小鼠90只，體質(zhì)量為（20±2）g，購自北京維通利華公司［動物合格證號：SCXK（京）2006－0009］。

1.2 試劑與儀器 PNS，四川金郁金科技有限公司（批號：050302）；注射用鹽酸博萊霉素（BLM），浙江海正藥業(yè)股份有限公司（批號：H20055883）；原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，羅氏公司（批號：mk1020）；免疫組化Bax抗體，Santa Cruz公司（批號：sc－526）；免疫組化 Bcl－2抗體，Santa Cruz公司（批號：sc－492）；免疫組化超敏兔二抗及DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒，北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶聯(lián)反應(yīng)（RT－PCR）試劑盒，F(xiàn)ermentas公司；Bax、Bcl－2及DAPDH引物，北京擎科生物工程有限公司；Takara TP600型梯度PCR儀，日本Takara公司；H1650－W臺式微量高速離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；超凈工作臺，北京鑫宏程潔凈工程技術(shù)有限公司；電泳儀，上海申能博彩生物科技有限公司；電泳槽（JY－SP－B型），北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制備、分組及給藥方法 90只C57BL／6雄性小鼠隨機(jī)分為3組，每組30只。分別為假手術(shù)組、模型組和PNS組。用4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥固定于鼠臺上，頸部乙醇消毒后逐層分離并暴露氣管，注射器經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管，然后緩慢滴入BLM（5mg／kg），注后立即將動物直立并左右旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布。其中假手術(shù)組小鼠肺部滴入等體積的生理鹽水（造模后存活良好）。術(shù)后第2天開始灌胃給藥，PNS組給藥劑量為60mg·kg－1·d－1，假手術(shù)組及模型組給予等體積生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠自由飲水和進(jìn)食。

1.3.2 標(biāo)本采集及指標(biāo)測定 小鼠在造模7、14、28d后分3次取材，每次各組隨機(jī)處死10只，共30只。取肺組織標(biāo)本，一部分用10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片用于TUNEL染色和免疫組織化學(xué)測定；一部分加入triton－100放置于液氮后，再放入低溫冰箱中保存以備提取總RNA，用于RT－PCR檢測。

1.3.3 TUNEL染色 按細(xì)胞凋亡檢測試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行，DAB顯色，細(xì)胞核呈棕褐色為陽性凋亡細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的半定量分析：在10×40倍視野下，每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野下凋亡細(xì)胞的數(shù)量，取平均數(shù)作為該組織切片凋亡細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)（AI）＝凋亡細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)×100%［6］。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色 按鏈霉素活素－生物素－過氧化物酶（SABC）法試劑盒提供的操作步驟進(jìn)行，Bax一抗以1∶150稀釋，Bcl－2一抗以1∶200稀釋。肺組織切片常規(guī)二甲苯、梯度乙醇脫蠟、抗原修復(fù)，血清封閉，滴加一抗，4℃冰箱過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡下見棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。每組標(biāo)本切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，采用NIS－ELEMENTS BR2.3專業(yè)圖像分析軟件對免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4.3 半定量RT－PCR法檢測 按照總RNA抽提試劑盒推薦的操作步驟抽提總RNA。按照RT－PCR試劑盒說明書推薦的操作步驟合成cDNA：取1.6μg RNA，以O(shè)ligo（dT）18為引物，組成10μL的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，42℃水浴60min后，70℃水浴10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，產(chǎn)物保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

各引物序列：Bax（209bp）上游引物，5′－GGC GAA TTG GAG ATG AAC TG－3′。下游引物，5′－GAT CAG CTC GGG CAC TTT AG－3′。Bcl－2（225bp）：上 游 引 物，5′－GCG TCA ACA GGG AGA TGT CA－3′。下游引物，5′－GGT ATG CAC CCA GAG TGA TG－3′。內(nèi)參對照DAPDH（231bp）。PCR反應(yīng)條件：94℃5min，95℃20s，58℃20s，72℃20s，35個(gè)循環(huán)；72℃7min，然后4℃終止。取上述PCR產(chǎn)物6μL，100V電壓，電泳40min。取出凝膠，紫外燈下觀察，拍照。用Image J圖像分析軟件分析，結(jié)果用灰度值表示，以目的條帶與GAPDH的灰度值比值，作為目的基因表達(dá)的相對水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析，計(jì)量資料以±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TUNEL染色結(jié)果 模型組可見TUNEL染色陽性的凋亡細(xì)胞主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和部分炎性細(xì)胞，廣泛分布于肺實(shí)質(zhì)，與假手術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。假手術(shù)組陽性染色的細(xì)胞少。與相同時(shí)間點(diǎn)模型組相比，PNS組肺組織氣道上皮細(xì)胞的凋亡明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠肺組織中TUNEL染色細(xì)胞凋亡率分析結(jié)果（±s，%）

表1 各組小鼠肺組織中TUNEL染色細(xì)胞凋亡率分析結(jié)果（±s，%）

a：P＜0.01，與假手術(shù)組比較；b：P＜0.01，與模型組比較。

組別2.09±0.26 2.06±0.19 1.93±0.16模型組 8.31±0.66a 10.74±0.49a 10.20±0.46a PNS組 5.45±0.69ab 6.01±0.44ab 5.67±0.45 7d 14d 28d假手術(shù)組ab

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果 模型組可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色表達(dá)產(chǎn)物明顯增多，Bax主要表達(dá)于肺損傷區(qū)細(xì)支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，有的已進(jìn)入細(xì)胞核。Bcl－2在肺損傷區(qū)肺間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)明顯增多，模型組Bax／Bcl－2各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Bax／Bcl－2在假手術(shù)組表達(dá)很少，在PNS組表達(dá)明顯減少，與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見表2、3。

表2 各組小鼠肺組織中Bax蛋白免疫組化圖像積分光密度值（IOD）分析結(jié)果（±s，n＝8）

表2 各組小鼠肺組織中Bax蛋白免疫組化圖像積分光密度值（IOD）分析結(jié)果（±s，n＝8）

a：P＜0.01，與假手術(shù)組比較；b：P＜0.01，與模型組比較。

組別4.06±0.84 3.98±0.59 4.15±0.75模型組 8.61±0.95a 9.94±0.68a10.75±1.27a PNS組 4.88±0.79b 5.27±0.81b 5.03±0.84 7d 14d 28d假手術(shù)組b

表3 各組小鼠肺組織中Bcl－2蛋白免疫組化IOD分析結(jié)果（±s，n＝8）

表3 各組小鼠肺組織中Bcl－2蛋白免疫組化IOD分析結(jié)果（±s，n＝8）

a：P＜0.01，與假手術(shù)組比較；b：P＜0.01，與模型組比較。

組別3.52±0.47 3.71±0.49 3.53±0.64模型組 7.93±0.95a 8.67±0.77a 8.37±0.94a PNS組 4.27±0.81b 4.68±0.62b 4.81±0.73 7d 14d 28d假手術(shù)組b

2.3 RT－PCR結(jié)果 模型組在各時(shí)間點(diǎn)時(shí)Bax mRNA／Bcl－2 mRNA的含量均明顯升高，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。與模型組比較，PNS組降低了纖維化肺組織中Bax mRNA／Bcl－2mRNA的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），結(jié)果見表4、5。

表4 各組小鼠肺組織中Bax mRNA分析結(jié)果（±s，n＝3）

表4 各組小鼠肺組織中Bax mRNA分析結(jié)果（±s，n＝3）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與假手術(shù)組比較；c：P＜0.05，d：P＜0.01與模型組比較。

組別0.367 0±0.089 0 0.314 2±0.019 7 0.339 7±0.069 1模型組 0.761 3±0.100 1a0.821 0±0.195 2b 0.910 0±0.230 0b PNS組 0.489 6±0.190 0c 0.541 3±0.055 0d 0.491 5±0.215 4 7d 14d 28d假手術(shù)組c

表5 各組小鼠肺組織中Bcl－2mRNA圖像分析結(jié)果（±s，n＝3）

表5 各組小鼠肺組織中Bcl－2mRNA圖像分析結(jié)果（±s，n＝3）

a：P＜0.05，與假手術(shù)組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與模型組比較。

組別0.263 2±0.066 5 0.282 6±0.060 4 0.313 5±0.028 2模型組 0.599 6±0.058 2a0.809 7±0.106 5a0.793 3±0.245 0a PNS組 0.328 7±0.036 6b 0.402 5±0.110 1b 0.371 8±0.085 1 7d 14d 28d假手術(shù)組c

3 討 論

細(xì)胞凋亡是一種廣泛存在于多細(xì)胞生物體內(nèi)，對不需要的細(xì)胞和受損傷的細(xì)胞發(fā)生的由眾多基因參與調(diào)控的細(xì)胞自主的有序死亡過程，在組織損傷修復(fù)過程中，通過細(xì)胞凋亡機(jī)制不僅可以限制炎癥反應(yīng)的發(fā)展，而且可防止炎癥后纖維增生和瘢痕形成。有研究表明，上皮細(xì)胞過度凋亡，使其抑制成纖維細(xì)胞增殖的功能喪失，從而導(dǎo)致成纖維細(xì)胞過度增生，產(chǎn)生過多的膠原蛋白而發(fā)生器官纖維化［7］。

肺纖維化是以細(xì)支氣管和肺泡上皮細(xì)胞過度凋亡，導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞以及肺成纖維細(xì)胞凋亡受抑為特征。

TUNEL染色結(jié)果顯示，在BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，7、14、28d肺組織的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于對照組（P＜0.01）。凋亡第7天起明顯增強(qiáng)，并持續(xù)至第14、28天時(shí)凋亡指數(shù)最高。凋亡的細(xì)胞主要為支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，還有少量肺間質(zhì)細(xì)胞。與模型組比較，PNS組能顯著降低肺纖維化小鼠肺組織上皮細(xì)胞的凋亡（P＜0.01）。

細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，多種基因及其表達(dá)產(chǎn)物如Bax、Bcl－2和Bad等參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，其中Bcl－2基因家族是最受重視的基因之一。Bcl－2主要通過線粒體途徑，來發(fā)揮其抗凋亡作用［8］。Bax主要作用是通過自身形成同源二聚體或與Bcl－2作用形成異源二聚體，來參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。Bax同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，Bax／Bcl－2異源二聚體則抑制細(xì)胞凋亡。因此細(xì)胞的凋亡與Bax／Bcl－2的比值有關(guān)，Bax蛋白的表達(dá)量多于Bcl－2的表達(dá)量時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，反之則抑制細(xì)胞凋亡［9］。

在TUNEL染色實(shí)驗(yàn)中作者已經(jīng)看到支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和部分炎性細(xì)胞的凋亡，說明這些細(xì)胞的凋亡參與肺纖維化的形成。免疫組化結(jié)果提示：（1）肺內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞是Bax的主要來源之一，Bax在肺纖維化實(shí)質(zhì)細(xì)胞的過度凋亡中發(fā)揮重要作用；（2）增多的Bcl－2主要是由肺間質(zhì)細(xì)胞分泌的，Bcl－2在抑制成纖維細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。綜合以上研究說明，肺纖維化時(shí)，肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞的凋亡過度可能與局部Bax的表達(dá)升高、Bcl－2表達(dá)下降使肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞Bax／Bcl－2比值升高有關(guān)，而肺間質(zhì)細(xì)胞Bcl－2的過度表達(dá)，可能與成纖維細(xì)胞的凋亡受抑有關(guān)，從而使成纖維細(xì)胞的增殖多于凋亡，促進(jìn)肺纖維化的進(jìn)展。應(yīng)用RT－PCR方法研究表明，模型組小鼠肺組織Bax mRNA和Bcl－2mRNA的表達(dá)亦明顯增加（P＜0.01或P＜0.05），表明Bax和Bcl－2對肺纖維小鼠肺組織細(xì)胞凋亡的調(diào)控至少是在蛋白轉(zhuǎn)錄或翻譯水平進(jìn)行的。

以上研究結(jié)果提示，通過選擇性地調(diào)節(jié)細(xì)胞中Bax和Bcl－2的表達(dá)，抑制肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞的凋亡和成纖維細(xì)胞的增生，就有可能在治療肺纖維化方面取得一定的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PNS能在一定程度上抑制肺組織氣道上皮的凋亡，從蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)肺纖維化小鼠肺組織中Bax和Bcl－2的表達(dá)。據(jù)此，作者初步認(rèn)為PNS抗肺纖維的作用機(jī)制可能與PNS抑制肺組織氣道上皮的凋亡、調(diào)節(jié)Bax／Bcl－2的表達(dá)有關(guān)，更詳細(xì)的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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