機械和感染雙重損傷法建立新西蘭大白兔宮腔粘連模型＊

劉 芳，何援利

（南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州510282）

宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUA）是宮腔操作的嚴重并發(fā)癥，可以引起不孕、月經(jīng)過少、閉經(jīng)或反復流產(chǎn)［1］。近年IUA的發(fā)病率和檢出率呈上升趨勢，已成為女性繼發(fā)不孕的第二大病因［2］。目前，臨床針對IUA的治療盡管能恢復宮腔的形態(tài)，但對于子宮生理功能的恢復尚屬于臨床治療的難題，導致IUA的治愈率和妊娠率無明顯改善，而且中、重度IUA治療后復發(fā)率較高［3］，因此，IUA的診斷和治療日益受到臨床的重視。目前研究認為，IUA的病因主要有創(chuàng)傷［4］、感染［5］、子宮內(nèi)膜修復障礙和低雌激素狀態(tài)［1］。為此，本研究擬建立兔IUA動物模型，探討其發(fā)病機制和治療方案，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇普通級成年雌性新西蘭大白兔60只，10～12周齡，體質(zhì)量2.500～3.500kg，常規(guī)單籠飼養(yǎng)適應環(huán)境1周后，隨機分為4組：對照組15只，機械損傷組15只，感染損傷組15只，雙重損傷組15只。

1.2 脂多糖棉線制備 細菌脂多糖（LPS，購自SIGMA公司，來源于Escherichia coli 055：B5）溶于生理鹽水配成濃度為6mg／L溶液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。造模?d準備20cm長的10號醫(yī)用無菌手術線，在4℃脂多糖生理鹽水溶液中浸泡24h備用。

1.3 造模方法 按5mL／kg耳緣靜脈注射20%烏拉坦麻醉。機械損傷組隨機取一側(cè)子宮，于子宮中下1／3處做0.5cm縱切口，用直徑4mm子宮內(nèi)膜刮勺刮取中上段子宮內(nèi)膜，當感覺子宮四壁粗糙時，停止刮宮，縫合子宮切口，生理鹽水沖洗腹腔。感染損傷組隨機取一側(cè)子宮，于子宮中下1／3處做0.5 cm縱切口，宮腔留置脂多糖棉線，棉線殘端留置于腹部，留長約3cm尾絲，剪去多余棉線，2d后輕拉尾絲，取出宮腔內(nèi)棉線。雙重損傷組機械損傷后，將脂多糖棉線置入損傷段子宮，2 d后取出子宮腔內(nèi)棉線（圖1B）。對照組只開腹，不損傷子宮。分別于損傷后2、14、28d分批處死3只新西蘭大白兔，損傷后7d處死6只，收集子宮組織（圖1）。

1.4 子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量纖維化檢測 兔子宮組織樣本的石蠟切片分別行HE和馬松三色染色（massons trichrom stain，Masson染色）。每張HE染色切片選取4個高倍鏡視野，計數(shù)每個視野下腺體數(shù)量，取其平均值。纖維化面積比率計算方法：每張Masson切片選取4個視野，纖維化面積比率為每個視野子宮內(nèi)膜間質(zhì)纖維化的總面積除以子宮內(nèi)膜間質(zhì)和腺體面積之和，取平均值，以圖像分析系統(tǒng)自動計算完成。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單向方差（One way ANOVA）和SNK法分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

子宮內(nèi)膜間質(zhì)微血管豐富。Masson染色鏡下觀察見黏膜、黏膜下層、血管和肌肉呈暗紅色；子宮內(nèi)膜間質(zhì)膠原纖維呈藍色，梭狀，排列較整齊（圖2）。子宮內(nèi)膜機械損傷后2d，70%～80%宮腔表面有上皮細胞再生，但無腺體再生。間質(zhì)出血、水腫、白細胞浸潤，出現(xiàn)少量凝固性壞死，間質(zhì)裸露區(qū)有纖維素樣滲出；損傷后7d，宮腔表面幾乎全部覆蓋上皮細胞，再生上皮層下出現(xiàn)一些腺體，上皮表面偶可見腺體開口。間質(zhì)層纖維組織增多，膠原聚集，少量新生毛細血管（圖2B）；損傷后14d宮腔表面上皮和腺體完全再生。間質(zhì)少量白細胞和巨噬細胞浸潤，部分間質(zhì)纖維化，膠原聚集。新生毛細血管增多；損傷后28d子宮內(nèi)膜形態(tài)學基本恢復正常，間質(zhì)無充血和淋巴細胞浸潤，少數(shù)間質(zhì)區(qū)可見纖維化改變。

感染損傷的子宮移去脂多糖棉線2d后宮腔表面均有子宮內(nèi)膜細胞覆蓋，上皮下無腺體。間質(zhì)有炎性反應；損傷后7 d，宮腔表面覆蓋柱狀上皮細胞，上皮下多量腺體，表面可見腺體開口。間質(zhì)仍可見炎性改變（圖2C）；損傷后14d宮腔表面上皮和腺體完全再生。間質(zhì)白細胞浸潤。毛細血管無擴張、充血；損傷后28d子宮內(nèi)膜形態(tài)學恢復正常，間質(zhì)無充血和淋巴細胞浸潤。

圖1 兔子宮造模前、后照片

圖2 正常及損傷后7d兔子宮內(nèi)膜

表1 損傷后7d兔子宮內(nèi)膜纖維化面積比率與腺體數(shù)量比較

子宮內(nèi)膜雙重損傷后2d，宮腔偶有扁平上皮細胞再生，宮腔大量纖維素滲出以及壞死組織碎片。間質(zhì)出血，水腫，淋巴細胞浸潤，部分區(qū)域纖維化，膠原纖維增加。一些毛細血管管腔閉鎖；損傷后7d，宮腔部分閉鎖，縱行剖開，大體可見一些較牢固纖維性粘連帶。鏡下可見纖維性粘連帶增厚，70%～80%未粘連區(qū)域覆蓋扁平上皮細胞，上皮層下可見極少量腺體。80%～90%間質(zhì)區(qū)纖維化增生，膠原纖維聚集，間質(zhì)毛細血管稀少；損傷后14d宮腔改變和損傷后7d類似，但宮腔未粘連區(qū)域基本由無功能的扁平上皮細胞覆蓋，上皮層下腺體稀疏。損傷后28d子宮內(nèi)膜形態(tài)學未恢復，宮腔瘢痕修復。損傷后7 d兔子宮內(nèi)膜纖維化面積比率與腺體數(shù)量見表1。

3 討 論

創(chuàng)傷和感染是IUA發(fā)生的兩個主要高危因素［6］。本研究根據(jù)IUA發(fā)生的主要高危因素設計了3種方法建立IUA動物模型。其中機械損傷方法可以完全刮除子宮內(nèi)膜表面上皮以及部分間質(zhì)，引起新西蘭大白兔的子宮內(nèi)膜全層損傷，但在損傷后短時間內(nèi)子宮內(nèi)膜上皮細胞即開始再生，子宮內(nèi)膜間質(zhì)的修復過程較慢，損傷后28d少數(shù)間質(zhì)區(qū)仍有纖維化改變，但子宮內(nèi)膜上皮的形態(tài)學基本恢復。這說明僅用機械損傷的方法對子宮內(nèi)膜上皮再生過程影響較小。

感染可促使IUA進一步發(fā)展已基本得到學者的共識［7］。宮腔操作引起的繼發(fā)感染、急慢性子宮內(nèi)膜炎、產(chǎn)褥感染等均可導致子宮內(nèi)膜的炎癥反應，抑制子宮內(nèi)膜修復，甚至破壞正常子宮內(nèi)膜，促進子宮內(nèi)膜纖維化增生，導致IUA形成［8］。本研究中用感染損傷的方法雖然也能引起子宮內(nèi)膜的部分脫落和間質(zhì)的炎癥反應，但其引起的損傷是完全可逆的，在損傷后7d子宮內(nèi)膜組織完全再生。提示單純的感染對子宮內(nèi)膜腺上皮損傷后修復的影響較小，雖然引起子宮內(nèi)膜間質(zhì)纖維化暫時性增加，但可能由于子宮腔表面有腺上皮覆蓋，幾乎不形成纖維粘連。

采用機械和感染雙重方法損傷子宮內(nèi)膜后，在損傷后2d宮腔內(nèi)沒有再生的上皮細胞覆蓋，致使子宮內(nèi)膜間質(zhì)的纖維化滲出阻塞了宮腔，損傷后7d形成粘連帶，損傷發(fā)生了不可逆的改變，子宮內(nèi)膜瘢痕修復。子宮內(nèi)膜損傷后完全再生可能取決于2個因素：（1）子宮內(nèi)膜表面上皮細胞的迅速再生，覆蓋子宮內(nèi)膜創(chuàng)面；（2）較輕的炎癥反應［9］。子宮內(nèi)膜損傷后，子宮內(nèi)膜表面上皮再生延遲可能是宮腔粘連形成的關鍵［10］，由于缺乏足夠的再生上皮細胞覆蓋宮腔表面，間質(zhì)裸露，間質(zhì)纖維活性增加，加之炎癥引起的纖維性滲出，子宮內(nèi)膜瘢痕修復，引起宮腔粘連。

隨著對IUA的研究深入，研究者意識到IUA的形成是多種損傷因素共同作用的結果［11］。由于子宮內(nèi)膜再生能力強，單一的方法損傷后，子宮內(nèi)膜在短時間內(nèi)完全再生，難以構建IUA模型，因此，采用兩種以上的損傷方法聯(lián)合可能更易于建立IUA動物模型。Chen等［12］根據(jù)創(chuàng)傷和低雌激素狀態(tài)的病因采用刮宮和切除卵巢降低雌激素水平兩種方法聯(lián)合建立了兔IUA模型，有助于研究和妊娠子宮宮腔操作后IUA發(fā)生的機制。而Li等［13］用刮宮后放置銅絲的方法建立了兔子宮內(nèi)膜損傷的模型，但宮腔沒有粘連帶形成，可能是因為銅絲雖然抑制了子宮內(nèi)膜上皮細胞再生，同時也抑制了宮腔內(nèi)纖維化粘連帶的形成，盡管模型沒有宮腔粘連形成，但子宮內(nèi)膜容受性降低，對于研究子宮內(nèi)膜損傷引起的胚胎著床失敗有重要的作用。

本研究顯示，IUA的主要病因是創(chuàng)傷和感染，采用機械和感染雙重損傷方法建立新西蘭大白兔IUA動物模型，對子宮內(nèi)膜的機械損傷能基本清除子宮內(nèi)膜層；同時在術后立即置入脂多糖棉線，2d后取出脂多糖棉線，一方面在子宮內(nèi)膜再生過程開始之前即抑制子宮內(nèi)膜再生，另一方面脂多糖加重了炎癥反應［14］，有助于瘢痕修復，而且及時取出棉線也不影響宮腔纖維化粘連帶的形成。綜合以上因素，雙重損傷法能建立穩(wěn)定的IUA模型。

該模型的建立可以從基因、蛋白以及干細胞等多個角度深入研究IUA的發(fā)病機制，而且可以作為一個平臺從細胞因子、生物材料以及干細胞移植等方面探求新的治療方法并檢測其有效性及安全性。

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