核苷（酸）類似物治療對乙型肝炎病毒感染者聚合酶區(qū)基因變異的影響

潘洪洋 楊 方 張明香 魏 倪 楊 樺 林 松

我們采用PCR產(chǎn)物直接測序法[1，2]對471例進(jìn)行了HBV-P-RT區(qū)基因序列分析的CHB患者進(jìn)行橫截面分析，以進(jìn)一步了解與耐藥相關(guān)的基因變異特點(diǎn)。

資料與方法

一、病例來源 2007年5月～2010年2月在我院住院的CHB患者255例，乙型肝炎肝硬化216例，男性355例，女性116例，中位年齡為46（10～85）歲，診斷符合我國2005年制定的慢性乙型肝炎防治指南[3]。全部患者血清HBV DNA陽性，平均水平為5.57±1.35lg拷貝/毫升，其中HBeAg陽性284例（60.3%）。

二、HBV-RT區(qū)基因序列分析 空腹采集靜脈血。引物序列為：上游：5'-CTTTCGCAAGATTCCTATGGGA-3'，下游：5'-CCCCAACTTCCAATTACATATC-3'。采用巢式PCR法對HBV-RT區(qū)基因擴(kuò)增（四川天澤基因工程有限公司），產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定和回收純化后，進(jìn)行雙向DNA序列測定（美國ABI公司3130全自動DNA測序儀），與GenBank參考序列進(jìn)行比對，獲得樣本的突變位點(diǎn)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS l3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，否則采用中位數(shù)（四分位間距）表示，組間比較采用方差分析或秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、未治療患者HBV-P基因RT區(qū)變異情況 在292例未接受抗病毒治療的患者中，檢測到與NA耐藥相關(guān)的錯義變異6例（2.0%），包括M204I3例、A181T 1例和V173L 2例。同義變異25例（8.5%），包括180位點(diǎn)14例、181和236位點(diǎn)各3例及169和180聯(lián)合變異5例。

二、停用NA治療后患者發(fā)生HBV-P基因RT區(qū)變異情況 在49例曾經(jīng)應(yīng)用過NA治療患者，在停藥至少3月后，9例（18.4%）檢測到變異位點(diǎn)，包括經(jīng)典耐藥位點(diǎn)的錯義和同義變異（表1）。

表1 停用NA治療后9例患者發(fā)生HBV-P-RT變異及類型

三、應(yīng)用NA治療期間發(fā)生HBV-P基因RT區(qū)變異情況 130例（27.6%）患者在接受NA治療過程中，在他們中檢測到與NA相關(guān)的錯義變異50例（38.5%，表2），檢測到同義變異20例（15.4%，表3）。

四、變異患者血清HBV DNA和ALT水平的變化 見表4。

討論

我們根據(jù)患者應(yīng)用NA治療情況將患者分為未抗病毒治療者、曾經(jīng)接受過抗病毒治療者和正在接受抗病毒治療者，結(jié)果均檢測到氨基酸置換位點(diǎn)，其變異模式與既往報(bào)道一致[4～7]。在未經(jīng)NA治療的患者，報(bào)道的結(jié)果各異。2008年Nguyen[8]分別采用克隆測序法和PCR-直接測序法在未經(jīng)NA治療的HBsAg攜帶者體內(nèi)均未檢出與耐藥相關(guān)的變異。近來，李曉光等[9]用PCR-直接測序法檢測未經(jīng)NA治療的CHB患者，亦未發(fā)現(xiàn)與耐藥相關(guān)的變異。相反，2001年Kobayashi等[10]用PCR-克隆測序法檢測18例未經(jīng)抗病毒治療的慢性HBV感染者，結(jié)果5例患者檢出了rtM204I耐藥變異。我們采用PCR-直接測序法在從未接受抗病毒治療者及曾經(jīng)抗病毒者中分別檢測到6例（2.0%）和5例（10.2%）與耐藥相關(guān)的變異。

我們在正在接受抗病毒治療的患者中發(fā)現(xiàn)1例應(yīng)用LdT初治24個月后出現(xiàn)rtA181T變異，1例在應(yīng)用ADV初治12個月后發(fā)生rtM204I變異；在曾經(jīng)抗病毒治療的患者中發(fā)現(xiàn)1例ADV單藥治療5個月后停藥7個月發(fā)生rtM204I+V173L變異，1例ETV單藥治療1年后停藥1年發(fā)生rtV173L+rtN236同義變異，這些在以前未見類似報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。

表2 50例患者在應(yīng)用NA治療期間發(fā)生HBV-P基因RT區(qū)錯義變異及類型

表3 21例應(yīng)用NA治療期間患者HBV-P基因RT區(qū)同義變異類型及用藥史

表4 變異患者血清HBV DNA和ALT水平（±s）的比較

表4 變異患者血清HBV DNA和ALT水平（±s）的比較

例數(shù) HBV DNA（lgcopies/ml）ALT（U/L）錯義變異 505.6±1.489±53同義變異 205.3±1.193±67未變異 605.0±1.599±48

遺傳密碼具有多重性，即決定一個氨基酸的密碼子大多不止一個，三聯(lián)體密碼子中一個核苷酸的置換若不改變氨基酸的組成，最終得到的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能也不會發(fā)生變化，這樣的變異被稱為同義變異。但Kimchi-Sarfaty等[11]研究發(fā)現(xiàn)多藥耐藥-1（multidrug resistance-1，MDR-1）基因的同義變異可降低化療藥物的活性。沈銀忠等[12]研究發(fā)現(xiàn)光滑念珠菌ERG11基因的同義變異導(dǎo)致的光滑念珠菌對氟康唑耐藥。本研究在三組患者中均檢測到相當(dāng)數(shù)量的同義變異，其中正在抗病毒治療的患者耐藥相關(guān)錯義變異發(fā)生率高于測序時未治療者，同義變異在從未抗病毒治療者、曾經(jīng)抗病毒治療者及正在抗病毒治療者中逐漸升高，但同義變異對測序時HBV DNA水平的影響似乎不大。

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