排空強(qiáng)飼法測(cè)定雞飼糧表觀代謝能值的靈敏度與置信限

王美琴 趙 峰 賈 剛 劉成玲 王鈺明 張宏福

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，雅安 625014;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

排空強(qiáng)飼法已被我國(guó)采用并作為評(píng)定雞飼料代謝能值的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T 26437—2010)［1］。但是其測(cè)試過(guò)程繁瑣，在單一飼料原料的重復(fù)測(cè)定中，直接法的最大相對(duì)偏差為0.7%～4.6%［2］，套算法則高達(dá) 58.5%［3］。由此可見(jiàn)，使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)飼糧間代謝能值的差異進(jìn)行識(shí)別時(shí)，尚需要對(duì)該方法的靈敏性及置信限等進(jìn)行進(jìn)一步分析，以規(guī)范其適用范圍。目前，在排空強(qiáng)飼法測(cè)定雞飼糧代謝能值的可靠性上，研究工作主要集中在方法的實(shí)驗(yàn)室間再現(xiàn)性變異系數(shù)［4-5］，重復(fù)批次間的批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)［6］，代謝能值測(cè)定的變異因素來(lái)源等［6-7］方面。而在排空強(qiáng)飼法的靈敏度上，即樣品的代謝能值變化后，排空強(qiáng)飼法所檢測(cè)到的代謝能值有多大變化?能被排空強(qiáng)飼法所區(qū)分的飼糧間表觀代謝能(AME)有顯著差異的最小值，即樣品間AME差異的置信限是多少?這些基礎(chǔ)參數(shù)仍鮮見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。為了檢驗(yàn)排空強(qiáng)飼法測(cè)定雞飼糧AME值的靈敏度及樣品間差異的置信限，首先需要建立飼糧AME梯度并確定稀釋劑與飼糧養(yǎng)分間的互作效應(yīng)是否可以忽略不計(jì)，在此基礎(chǔ)上，檢驗(yàn)飼糧AME變化后排空強(qiáng)飼法測(cè)定AME值的響應(yīng)量，以檢測(cè)其靈敏性。然后，根據(jù)空白測(cè)試、飼糧AME值測(cè)定的方差，按照統(tǒng)計(jì)學(xué)原理估測(cè)排空強(qiáng)飼法測(cè)定樣品間AME值差異的置信限。綜合以上2個(gè)方面的結(jié)果，旨在為排空強(qiáng)飼法測(cè)定雞飼糧AME值的靈敏度與置信限提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)動(dòng)物管理

本研究分為2個(gè)試驗(yàn)，其中試驗(yàn)1旨在考察飼糧中添加一定比例的稀釋劑(花生殼)后能否建立相應(yīng)梯度的AME值，以及排空強(qiáng)飼法能檢測(cè)到的AME值顯著反應(yīng)量的大小。采用2×5兩因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，其中基礎(chǔ)飼糧設(shè)2個(gè)水平，即AME與粗蛋白質(zhì)水平與NRC(1994)推薦最低需要量相等的飼糧1，AME與粗蛋白質(zhì)水平比 NRC(1994)推薦最低需要量高10%的飼糧2。稀釋劑設(shè)5個(gè)水平，即在基礎(chǔ)飼糧中分別添加2%、4%、6%、8%和10%的花生殼，形成不同AME梯度的10個(gè)飼糧。AME測(cè)定中選取體重2.0 kg、無(wú)怪癖的健康成年海蘭褐殼蛋公雞96只，隨機(jī)分成4組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4只雞，單籠飼養(yǎng)于代謝籠中，分批次測(cè)定試驗(yàn)飼糧的AME值。

試驗(yàn)2通過(guò)分析空白樣品、靈敏度測(cè)試中飼糧AME值的方差是否相等，確定排空強(qiáng)飼法中飼糧AME值標(biāo)準(zhǔn)差的平均值，根據(jù)兩樣本統(tǒng)計(jì)顯著性原理，計(jì)算2個(gè)樣品間AME值的差異顯著時(shí)對(duì)應(yīng)的置信限?？瞻讟悠窚y(cè)試數(shù)據(jù)為:考察絕食條件下，即空白樣品條件下，假定強(qiáng)飼50 g(風(fēng)干物質(zhì))完全不消化的飼糧樣品為空白樣品，測(cè)定空白樣品的AME值。選取體重2.0 kg、無(wú)怪癖的健康成年海蘭褐殼蛋公雞96只，隨機(jī)分成4組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3只雞，單籠飼養(yǎng)于代謝籠中，分4個(gè)批次重復(fù)測(cè)定內(nèi)源能的排泄量。靈敏度測(cè)試數(shù)據(jù)為試驗(yàn)1中的代謝試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

所有試驗(yàn)動(dòng)物均自由采食，通過(guò)乳頭飲水器自由飲水，每日光照12 h，代謝室的溫度維持在25℃。日常管理按照動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)飼養(yǎng)管理程序進(jìn)行。代謝試驗(yàn)期間按GB/T 26437—2010進(jìn)行管理。

1.2 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 代謝試驗(yàn)過(guò)程

代謝試驗(yàn)過(guò)程參照GB/T 26437—2010，具體操作程序:代謝試驗(yàn)預(yù)試期3 d，最后1次飼喂試驗(yàn)飼糧;排空48 h后強(qiáng)飼試驗(yàn)飼糧50 g(精確到0.000 2 g)，并準(zhǔn)確記錄每只試驗(yàn)雞的強(qiáng)飼結(jié)束時(shí)間;排泄物收集48 h后，試驗(yàn)雞進(jìn)入10 d以上的恢復(fù)期，恢復(fù)期及預(yù)試期前2天飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧(表1)，并自由飲水。排泄物的制備與分析:排泄物收集完成后，立即將其置于65℃的烘箱中烘干至恒重，回潮24 h后將每個(gè)重復(fù)內(nèi)雞的風(fēng)干排泄物總量稱重記錄，并粉碎過(guò)40目篩，立即取部分樣品按照GB/T 6435—1986測(cè)定其干物質(zhì)(DM)含量，并計(jì)算雞的DM排泄量。其余樣品封裝后置于-20℃冰箱保存待進(jìn)一步分析;總能的測(cè)定根據(jù)ISO 9831∶1998的規(guī)定進(jìn)行，并同步測(cè)定排泄物的DM含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

被測(cè)飼糧AME的計(jì)算:

式中:GE1為攝入總能(J);M1為攝入DM量(g);GE2為排泄物總能(J);AME為被測(cè)飼糧AME(MJ/kg DM)。

以SAS 9.0的MEANS模塊對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用ANOVA模塊對(duì)方差的齊次性進(jìn)行Levene’s檢驗(yàn)。GLM模塊對(duì)飼糧中稀釋劑水平與AME的線性關(guān)系、二次方關(guān)系及線性失擬進(jìn)行檢驗(yàn)。采用REG模塊對(duì)飼糧AME實(shí)測(cè)值與計(jì)算值的線性關(guān)系進(jìn)行回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 以花生殼為稀釋劑建立飼糧AME梯度的檢驗(yàn)

在NRC(1994)推薦的最低AME與蛋白質(zhì)水平飼糧(飼糧1)與高AME高蛋白質(zhì)水平飼糧(飼糧2)條件下，隨著花生殼(稀釋劑)水平以2%的梯度增加，飼糧的AME值依次降低。由表2可知，飼糧來(lái)源(飼糧1、2)和稀釋劑的水平對(duì)稀釋后飼糧的AME值均有顯著影響(P＜0.01)，但兩者對(duì)稀釋后飼糧的AME值無(wú)顯著交互效應(yīng)(P=0.056 9)。由此可見(jiàn)，2種飼糧在AME值上的顯著差異與本試驗(yàn)設(shè)計(jì)中飼糧1與飼糧2在AME與蛋白質(zhì)水平上相差10%相對(duì)應(yīng)，并且在稀釋劑添加水平相同的情況下，稀釋后的2種飼糧仍呈現(xiàn)差異。在稀釋劑水平與飼糧AME值的關(guān)系上，假設(shè)稀釋劑(花生殼)的AME值為0，則對(duì)10個(gè)稀釋后飼糧AME計(jì)算值(AMEc，根據(jù)飼糧1、2 AME的實(shí)測(cè)值乘以稀釋后飼糧中飼糧1、2的含量)與排空強(qiáng)飼法AME實(shí)測(cè)值分別作T檢驗(yàn)，兩者的差異均不顯著(P＞0.05)，這表明花生殼可以視為AME值為0的純稀釋劑，也進(jìn)一步說(shuō)明，花生殼對(duì)稀釋后2種飼糧的AME值的影響是相似的(即無(wú)互作效應(yīng))。2種飼糧條件下，稀釋劑的水平(2% ～10%)對(duì)稀釋后飼糧的AME值呈顯著的線性關(guān)系(P＜0.01)，而二次函數(shù)關(guān)系與線性失擬檢驗(yàn)均不顯著(P＞0.05)。綜合上述分析，通過(guò)增加稀釋劑的水平可以線性地建立不同AME梯度的飼糧。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

2.2 排空強(qiáng)飼法測(cè)定飼糧AME值的響應(yīng)量

在以花生殼為稀釋劑建立飼糧AME值的梯度中，已得出稀釋劑的水平與飼糧來(lái)源對(duì)稀釋后飼糧的AME值無(wú)互作效應(yīng)，且花生殼是AME值為0的稀釋劑。因此，在檢測(cè)排空強(qiáng)飼法對(duì)飼糧AME值的響應(yīng)量上，可以將10個(gè)飼糧視為屬于同一個(gè)系統(tǒng)。根據(jù)前述統(tǒng)計(jì)分析，在確定稀釋后飼糧AME的理論值上，通過(guò)排空強(qiáng)飼法(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法)測(cè)定飼糧1、2的AME值，然后按照稀釋后飼糧中稀釋劑的比例依次計(jì)算得出相應(yīng)的AMEc。根據(jù)化學(xué)分析中靈敏度的含義，引申AME值測(cè)定的靈敏度為被測(cè)飼糧AME改變1個(gè)單位AMEc的變化值(dAMEc)時(shí)所引起的排空強(qiáng)飼法檢測(cè)到的AME的變化值(dAME)，即 m=dAME/dAMEc。以AMEc為依變量，以排空強(qiáng)飼法AME實(shí)測(cè)值為應(yīng)變量作線性回歸分析(圖1)，得出dAME/dAMEc=0.987(P＜0.01)，這表明，排空強(qiáng)飼法檢測(cè)到的AME值對(duì)飼糧AME值的變化具有較高的靈敏度。

表2 稀釋劑的水平對(duì)飼糧AME值的影響Table 2 Effects of the level of diluent on dietary AME value MJ/kg DM

2.3 排空強(qiáng)飼法測(cè)定飼糧樣品間AME值差異的置信限

在AME值測(cè)定中，由于難以規(guī)范完全不消化的空白樣品實(shí)物，因此，空白樣品AME為假設(shè)強(qiáng)飼50 g完全不消化的飼糧樣品(本試驗(yàn)中飼糧DM含量為93.3%)所測(cè)得的 AME值，AME=(FEI-FEO-EEL)/(50×0.933)(式中，F(xiàn)EI為50 g空白飼糧的能量攝入量;FEO為空白飼糧來(lái)源的糞尿能排泄量;EEL為內(nèi)源能排泄量)。由于空白飼糧是完全不消化的，因此FEI=FE o，空白飼糧AME=-EEL/(50×0.933)。根據(jù)該公式，采用絕食法收集內(nèi)源排泄物可以測(cè)定空白飼糧的AME值。本研究中(表3)，通過(guò)4個(gè)批次，測(cè)定每只成年公雞的內(nèi)源能排泄量為57.29～70.56 kJ，批次間內(nèi)源能排泄量差異不顯著(P＞0.05)。相應(yīng)地，4個(gè)批次中，空白飼糧的AME值為-1.51～-1.23 MJ/kg DM，平均值為-1.38 MJ/kg DM。

圖1 飼糧AME實(shí)測(cè)值對(duì)AMEc的響應(yīng)量Fig.1 The response of determined AME value to AMEc

在空白樣品(內(nèi)源能排泄量)測(cè)定中，4個(gè)批次中樣品 AME的標(biāo)準(zhǔn)差在 0.16～0.38 MJ/kg DM，平均值為0.26 MJ/kg DM，批次間AME方差的差異不顯著(P=0.279 7)，這表明試驗(yàn)雞內(nèi)源能排泄量的變異是穩(wěn)定的。在10個(gè)飼糧的測(cè)定中，AME的標(biāo)準(zhǔn)差在0.11～0.24 MJ/kg DM，平均值為0.19 MJ/kg DM，飼糧AME間方差的差異不顯著(P=0.873 7)，這表明，排空強(qiáng)飼法測(cè)定飼糧AME的變異是穩(wěn)定的。通過(guò)對(duì)空白樣品與飼糧測(cè)定中AME的方差進(jìn)行比較，得出兩者的差異也不顯著(P=0.400 7)。由于排空強(qiáng)飼法中，飼糧的攝入量變異很小，所以飼糧AME值測(cè)定的變異主要來(lái)源于排泄物質(zhì)量的變異［6］。由此可以得出雞內(nèi)源能排泄量的變異與飼糧測(cè)定中糞尿能總排泄量的變異是接近的。

表3 絕食法測(cè)定空白樣品的AME值Table 3 The AME value of blank sample using fasting method

根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析中2個(gè)樣本差異比較的顯著性檢驗(yàn)原理［9］，當(dāng)2個(gè)樣品AME的差值大于集合標(biāo)準(zhǔn)誤的2.228倍時(shí)(df=10，α=0.05)，表明樣品的AME存在顯著性差異。因此，可以將該統(tǒng)計(jì)量作為排空強(qiáng)飼法測(cè)試飼糧樣品間AME差異的置信限。本試驗(yàn)中，14次AME測(cè)定的方差無(wú)統(tǒng)計(jì)顯著性差異(P＞0.05)，因此，將其平均值作為普通樣本的方差估計(jì)值，則2個(gè)樣本間的集合標(biāo)準(zhǔn)誤為 0 .21=0.12 MJ/kg DM，置信限為2.228×0.12=0.27 MJ/kg DM。

3 討論

3.1 排空強(qiáng)飼法測(cè)定飼糧AME值的靈敏度

從方法學(xué)的角度看，方法的可靠性需要從準(zhǔn)確度、精度、線性(靈敏度)、置信限等方面進(jìn)行綜合評(píng)估［10］。目前，在生物學(xué)法測(cè)定家禽飼糧代謝能值的重復(fù)性(精度)上已開展了許多研究工作［2，4-6］，而在方法的線性靈敏度上，以往的研究主要集中在幾種飼料原料間代謝能值的可加性研究［11-14］上。基本原理是通過(guò)單樣本T檢驗(yàn)，比較2種或多種原料混合后飼糧的代謝能實(shí)測(cè)值與根據(jù)單一原料代謝能實(shí)測(cè)值及飼糧中原料組成比例計(jì)算出的代謝能值，得出方法是否具有可加性。然而，對(duì)幾個(gè)飼糧進(jìn)行可加性檢驗(yàn)難以確定生物學(xué)法在多大范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性可加性，以及對(duì)飼糧的代謝能值發(fā)生變化后所測(cè)試到的代謝能值的反應(yīng)量也難以定量，因此，生物學(xué)法的可加性檢驗(yàn)并不能說(shuō)明方法的靈敏度。本研究中，在2種飼糧中加入2% ～10%的花生殼，使10個(gè)飼糧的AME值在12.14～14.13 MJ/kg DM的范圍內(nèi)呈梯度變化，通過(guò)排空強(qiáng)飼法檢測(cè)到飼糧的AME值在12.01～13.91 MJ/kg DM相應(yīng)變化，AME實(shí)測(cè)值對(duì)計(jì)算值的比例為0.987。這表明當(dāng)飼糧AME在2%的梯度以上變化時(shí)，排空強(qiáng)飼法能靈敏地反映 其變化。

表4 空白樣品和飼糧AME測(cè)定的方差齊次性檢驗(yàn)Table 4 Homogeneitytest of AME variance of blank sample and diets MJ/kg DM

3.2 排空強(qiáng)飼法測(cè)定飼糧樣品間AME值差異的置信限

在對(duì)2個(gè)或2個(gè)以上飼料原料或飼糧樣品的代謝能值進(jìn)行比較時(shí)，通常采用生物統(tǒng)計(jì)的兩樣本T檢驗(yàn)或方差分析的多重比較得出結(jié)論。但目前仍鮮見(jiàn)排空強(qiáng)飼法可準(zhǔn)確分辨飼料原料或飼糧間AME有顯著差異的最小值，即樣品間AME值差異的置信限。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)4次絕食代謝內(nèi)源能排泄量及10個(gè)飼糧AME值的方差比較，得出了飼糧間AME值的方差、內(nèi)源能排泄量的方差均無(wú)顯著性差異。這表明排空強(qiáng)飼法測(cè)定飼糧AME值時(shí)，測(cè)試結(jié)果的變異是穩(wěn)定的。由此得出，對(duì)飼糧而言，排空強(qiáng)飼法能區(qū)分樣品間AME值存在顯著差異時(shí)所需要的最低差值為0.27 MJ/kg DM，即為飼糧AME值的2.1%。而將Sibbald［11］對(duì)10個(gè)雞飼糧的真代謝能(TME)值測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行與本試驗(yàn)相同的分析后，得出排空強(qiáng)飼法測(cè)定飼糧樣品間 TME值差異的置信限為0.28 MJ/kg DM。由此可見(jiàn)，將0.27 MJ/kg DM作為排空強(qiáng)飼法測(cè)定飼糧間AME值差異的置信限是合適的。而對(duì)單一原料而言，直接法可測(cè)定的原料如谷實(shí)類飼料，因其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成不如飼糧平衡，排空強(qiáng)飼法測(cè)定AME值的方差可能比飼糧高，相應(yīng)地，區(qū)分飼料間AME值顯著差異的置信限比0.27 MJ/kg DM大一些。對(duì)套算法測(cè)定的飼料原料而言，因假設(shè)基礎(chǔ)飼糧的AME值是穩(wěn)定的，待測(cè)飼料在試驗(yàn)飼糧中占的比例在20%以上［15］，相應(yīng)地，區(qū)分飼料間AME值顯著差異的置信限最高可達(dá)0.27/0.2=1.35 MJ/kg DM。因此，對(duì)排空強(qiáng)飼法測(cè)定單一飼料原料的樣品間AME值差異的置信限還需要進(jìn)一步確定。

4 結(jié)論

①排空強(qiáng)飼法測(cè)定飼糧的AME值具有滿意的靈敏度。

②排空強(qiáng)飼法測(cè)定飼糧樣品間AME值是否有顯著差異的置信限為0.27 MJ/kg DM。

［1］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員.GB/T 26437—2010畜禽飼料有效性與安全性評(píng)價(jià)強(qiáng)飼法測(cè)定雞飼料表觀代謝能技術(shù)規(guī)程［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

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