采用PCR-DGGE技術(shù)分析瘤胃菌群在不同纖維素富集條件下的多樣性

曾 燕 孫 朋 倪學(xué)勤，2* 楊 杰 曾 東，2 張洪瑜，2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，雅安 625014;2.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014)

纖維素廣泛分布于自然界，是含量豐富的碳水化合物，占植物界碳含量的1/2以上［1］，而位于植物細(xì)胞壁纖維素之間起抗壓作用的木質(zhì)素卻難以被微生物和酶降解［2］。王占川等［3］研究表明，將秸稈開(kāi)發(fā)為飼料，使其轉(zhuǎn)化為畜產(chǎn)品將具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。纖維素通過(guò)瘤胃菌群發(fā)酵，可作為反芻動(dòng)物的重要能量來(lái)源。反芻動(dòng)物的瘤胃能同時(shí)為好氧、兼性厭氧和絕對(duì)厭氧微生物提供良好的棲息環(huán)境(溫度為39～41℃，pH為5.5～7.5)［4］。成年牛瘤胃中棲息的微生物包括200多種細(xì)菌、5個(gè)屬的真菌以及原蟲(chóng)和古菌。瘤胃菌群在數(shù)量上占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在纖維素分解過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［5］。劉開(kāi)朗等［6］統(tǒng)計(jì) 2008 年至2009年間在美國(guó)奶業(yè)科學(xué)協(xié)會(huì)-美國(guó)動(dòng)物科學(xué)學(xué)會(huì)(ADSA-ASAS)年會(huì)論文集、中國(guó)知網(wǎng)、PubMed等數(shù)據(jù)庫(kù)中與瘤胃菌群分子多態(tài)性和元基因組學(xué)相關(guān)的文獻(xiàn)有42篇。盡管對(duì)瘤胃菌群多樣性和功能的研究取得了一定進(jìn)展，但對(duì)其中影響宿主代謝和生產(chǎn)性能的關(guān)鍵功能菌的分離、鑒定、作用模式及其利用的研究仍處于初步階段，許多占優(yōu)勢(shì)的菌群至今還未在實(shí)驗(yàn)室里被分離出來(lái)。所以，研究瘤胃菌群，尤其是研究分解利用纖維素的菌群具有非常廣闊的前景。

長(zhǎng)久以來(lái)對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的研究主要采取細(xì)菌分離和培養(yǎng)的方法，不但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且結(jié)果不夠準(zhǔn)確，重復(fù)性差。通過(guò)純培養(yǎng)技術(shù)分離的微生物種類僅為11%左右［7］，大部分信息仍處于未知狀態(tài)。自Muyzer等［8］首次將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究以來(lái)，復(fù)雜的腸道微生物菌群得到了更加全面準(zhǔn)確的反映。由于反芻動(dòng)物瘤胃菌群數(shù)量龐大且種類繁多，直接對(duì)其進(jìn)行非特異的16SrDNA V3區(qū)DGGE分析，所得到的圖譜通常復(fù)雜且難以分辨。因此，本研究擬將瘤胃內(nèi)容物先進(jìn)行富集培養(yǎng)，而后采用PCRDGGE技術(shù)分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行聚類分析和主成分分析(PCA)，結(jié)合共性和特異性條帶的克隆和測(cè)序，評(píng)估反芻動(dòng)物瘤胃菌群在不同培養(yǎng)條件下的多樣性，旨在了解瘤胃細(xì)菌種類，為后續(xù)分離纖維素降解菌時(shí)培養(yǎng)條件的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集和處理

瘤胃內(nèi)容物采自四川省雅安市飛機(jī)壩屠宰場(chǎng)。無(wú)菌操作采集3份瘤胃內(nèi)容物，每份20～30 g，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑和儀器

PCR引物由英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司合成;2×Taq MasterMix(含染料)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;DGGE成套試劑購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;銀染藥品和試劑購(gòu)自四川瑞進(jìn)特科技有限公司;Gel Extraction Kit購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司;pMD19-T載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;PCR儀為MJ Research PTC-200(美國(guó)Bio-Rad公司);DGGE電泳儀為Dcode Universal Detection System［Bio-Rad(加拿大)］;核酸濃度測(cè)定儀為 ND-1000 UV-Vis Spectrphotometer(美國(guó)NanoDrop公司);凝膠成像系統(tǒng)為GS800 Calibrated Densitometer(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基

共采用4種培養(yǎng)基，羧甲基纖維素(CMC)培養(yǎng)基［9-10］、蛋白胨纖維素(PCS)培養(yǎng)基［11］、J培養(yǎng)基［12］和K培養(yǎng)基［CMC培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，無(wú)羧甲基纖維素鈉鹽(CMC-Na)、微晶纖維素和纖維素粉］。所有培養(yǎng)基121℃滅菌15 min備用。

1.2 富集培養(yǎng)

取3份樣品(編號(hào)為A、B、C)，分別稱取1 g瘤胃內(nèi)容物至裝有30 mL培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中。分別在37和50℃靜置培養(yǎng)48 h后搖勻分裝于1.5 mL EP管中，每管1 mL左右，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)菌總DNA的提取

參照文獻(xiàn)［13］提取細(xì)菌總DNA。用核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定總DNA濃度，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因組總DNA 16S r DNA V3區(qū)擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)［14］根據(jù)大腸桿菌16S rRNA基因V3片段(339～539 bp)設(shè)計(jì)合成引物。上游引物設(shè)計(jì)為帶GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)(帶下劃線的堿基序列)，序列為:5＇-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG T-3＇;下游引物序列為:5＇-GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3＇。PCR反應(yīng)體系(25μL):上、下游引物(10 pmol/μL)各 1.0 μL，2 × Taq MasterMix 12μL，總 DNA(模板)1.0～2.0μL，雙蒸水補(bǔ)足25μL，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照管。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物片段大小和濃度。

1.5 PCR-DGGE分析

參照文獻(xiàn)［15］進(jìn)行PCR-DGGE，凝膠電泳梯度為35%～65%(100%的變性劑包括7 mol/L尿素和40%甲酰胺)，變性方向與電泳方向一致。采用1×TAE作電泳緩沖液，100 V、60℃電泳14～16 h，結(jié)果經(jīng)硝酸銀進(jìn)行染色后用凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像。

1.6 割膠回收共性和特異性條帶并克隆和測(cè)序

將DGGE圖譜上的共性和特異性條帶分別割膠回收并浸泡在30μL加有0.1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的緩沖液中，4℃放置2 d。然后取1μL作為模板，按1.4方法再次擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳，確認(rèn)回收片段的正確性。重復(fù)該過(guò)程1～3次，直至在DGGE圖譜上得到單一的特定條帶。然后，取1μL回收純化的DNA為模板，采用1.4方法擴(kuò)增V3區(qū)，不同的是使用不帶GC發(fā)夾的引物，PCR產(chǎn)物用于下一步克隆。

采用pMD19-T載體試劑盒，參照使用手冊(cè)對(duì)模板PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，再將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含氨芐青霉素的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，每個(gè)條帶選取1～3個(gè)陽(yáng)性克隆送英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。應(yīng)用Chromas 2軟件對(duì)測(cè)定序列進(jìn)行編輯，非嵌合體序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析，尋找親緣關(guān)系最近的細(xì)菌或克隆。

1.7 數(shù)據(jù)分析

將DGGE圖譜數(shù)字化、標(biāo)準(zhǔn)化后得到1個(gè)記錄DGGE膠中條帶遷移位置的數(shù)字化矩陣，將矩陣導(dǎo)入SAS 9.1軟件和NTSYS 2.1軟件進(jìn)行聚類分析及主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃內(nèi)容物16SrDNAV3區(qū)基因片段的PCR-DGGE圖譜分析

瘤胃菌群數(shù)量龐大且種類繁多(圖1)，強(qiáng)的電泳條帶反映了瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌群，條帶數(shù)量和位置的復(fù)雜性代表細(xì)菌菌群的多樣性。不同纖維素富集培養(yǎng)基和溫度培養(yǎng)的瘤胃內(nèi)容物均產(chǎn)生了豐富的電泳條帶，但菌群結(jié)構(gòu)和組成存在較大差別。37℃條件下得到的樣品與50℃相比其細(xì)菌種類豐富度較高，用CMC培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品在37℃條件下平均條帶數(shù)為23，而在50℃條件下僅為15;同樣用PCS培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品在37℃條件下平均條帶數(shù)為19，而在50℃條件下為16。同一溫度條件下，條帶數(shù)多的樣品都集中分布在CMC培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基，這可能與纖維素對(duì)細(xì)菌的富集有關(guān)。

2.2 PCR-DGGE圖譜的聚類分析

聚類分析結(jié)果(圖2)顯示，不同纖維素富集條件影響樣品細(xì)菌的多樣性，在37℃的瘤胃內(nèi)容物中，J培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基間的相似性系數(shù)為0.77;J培養(yǎng)基和CMC培養(yǎng)基間的相似性系數(shù)僅為0.76。在50℃的瘤胃內(nèi)容物中，J培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基間的相似性系數(shù)為0.78;而CMC培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基間的相似性系數(shù)高達(dá)0.84。

溫度對(duì)瘤胃菌群的培養(yǎng)有一定影響，37℃的菌群聚為2個(gè)大族，而全部50℃的菌群聚為1個(gè)大族，PCS培養(yǎng)基和J培養(yǎng)基間的相似性系數(shù)在37℃僅為0.75，而在50℃高達(dá)0.97，這可能歸因于瘤胃菌群生存的環(huán)境溫度。

2.3 PCR-DGGE圖譜的主成分分析

對(duì)DGGE圖譜的主成分分析(圖3)同聚類分析的結(jié)果相一致。主成分因子1(PC1)的貢獻(xiàn)率為18.05%，主成分因子2(PC2)的貢獻(xiàn)率為10.02%;PC1明顯地將樣品分成2個(gè)部分，50℃的樣品主要分布在圖的右邊，37℃的樣品主要分布在圖的左邊;在50℃的樣品中，PC2將CMC培養(yǎng)基、PCS培養(yǎng)基和J培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品同K培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品區(qū)別開(kāi)來(lái);37℃的樣品中，PC2同樣將CMC培養(yǎng)基、PCS培養(yǎng)基和J培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品同K培養(yǎng)基培養(yǎng)的樣品基本分開(kāi)。

圖1 不同培養(yǎng)基和溫度培養(yǎng)后瘤胃內(nèi)容物16S r DNA V3區(qū)基因片段的PCR-DGGE圖譜Fig.1 PCR-DGGE profiles of gene fragments of 16SrDNA V3region of rumen contents after cultured in different mediums at different temperatures

2.4 共性和特異性瘤胃菌群分析

DGGE圖譜上割膠回收的2個(gè)共性條帶和4個(gè)特異性條帶(圖1箭頭所指)，2個(gè)共性條帶為優(yōu)勢(shì)菌群，克隆測(cè)序后在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)分析，找出了最相近的菌種，結(jié)果見(jiàn)表1。不同條件培養(yǎng)后的瘤胃菌群結(jié)構(gòu)豐富，代表優(yōu)勢(shì)菌群的條帶屬于解沒(méi)食子酸鏈球菌(Streptococcus gallolyticus)和解脲芽孢桿菌(Ureibacillus themosphaericus)2個(gè)菌屬。本試驗(yàn)回收的幾個(gè)主要特異性條帶屬于解沒(méi)食子酸鏈球菌、摩氏假單胞菌(Pseudomonas mosselii)、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)和未培養(yǎng)毛螺旋菌(uncultured Lachnospiraceae)4個(gè)菌屬。

在6個(gè)測(cè)序結(jié)果中，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中細(xì)菌的同源性絕大多數(shù)都到達(dá)了100%，而條帶1和條帶4同數(shù)據(jù)庫(kù)中與之同源性最高的未培養(yǎng)微生物的相似性也達(dá)到了99%，說(shuō)明試驗(yàn)中所得的序列與已鑒定的微生物親緣性非常高。

圖2 PCR-DGGE圖譜的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of PCR-DGGE profiles

圖3 PCR-DGGE圖譜的主成分分析Fig.3 PCA analysis of PCR-DGGE profiles

3 討論

3.1 不同培養(yǎng)條件下瘤胃內(nèi)容物16SrDNAV3區(qū)基因的PCR-DGGE圖譜分析

瘤胃菌群數(shù)量大，種類繁多，多樣性豐富［16］。DGGE圖譜(圖1)顯示不同培養(yǎng)基和溫度條件下，瘤胃細(xì)菌種類相當(dāng)豐富。CMC培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基富含豐富的CMC-Na、微晶纖維素和纖維素粉等成分，為瘤胃纖維素降解菌提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)原料。瘤胃菌群多樣性在37℃條件下高于50℃時(shí);CMC培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基培養(yǎng)的瘤胃菌群多樣性高于J培養(yǎng)基和K培養(yǎng)基。閆韓韓等［17］研究飼喂添加葡萄糖、尿素和無(wú)機(jī)鹽的飼糧后，羊的瘤胃菌群種類和數(shù)量均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。馮薇等［18］采用PCR-DGGE分析比較了奶牛瘤胃中附著于苜蓿、青貯玉米和羊草3種飼料固相黏附微生物區(qū)系，發(fā)現(xiàn)其微生物菌群構(gòu)成存在差異。同樣，本研究采用不同培養(yǎng)基和溫度評(píng)估瘤胃菌群，發(fā)現(xiàn)在不同纖維素培養(yǎng)基和溫度下瘤胃內(nèi)容物DGGE圖譜存在較大差異，可能是因?yàn)榱鑫讣?xì)菌對(duì)不同環(huán)境條件表現(xiàn)出不同程度的適應(yīng)性。

3.2 PCR-DGGE圖譜的聚類分析和主成分分析

聚類分析及主成分分析結(jié)果顯示，對(duì)于同一份瘤胃內(nèi)容物樣品，37℃條件下用CMC培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基所富集培養(yǎng)的菌群結(jié)構(gòu)較類似，可能是CMC和PCS2種培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分類似，為細(xì)菌的生長(zhǎng)提供了比較類似的營(yíng)養(yǎng)原料;而在50℃富集培養(yǎng)條件下，無(wú)論用CMC培養(yǎng)基，還是PCS培養(yǎng)基所富集培養(yǎng)的菌群結(jié)構(gòu)相似度非常高。因?yàn)榱鑫妇旱纳L(zhǎng)環(huán)境溫度為39～41℃，對(duì)于大多數(shù)瘤胃細(xì)菌而言，溫度高于50℃條件下即引起死亡［19］，僅有少數(shù)耐高溫的細(xì)菌能生存下來(lái)，如耐高溫的解脲芽孢桿菌，所以CMC培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基在50℃條件下的瘤胃菌群多樣性差異小。因此，對(duì)纖維素分解菌進(jìn)行富集培養(yǎng)時(shí)，可以從CMC培養(yǎng)基和PCS培養(yǎng)基中選取一種，同時(shí)選擇適當(dāng)?shù)臏囟取?/p>

表1 PCR-DGGE圖譜中共性和特異性條帶序列的Blast分析Table 1 Blast analysis of sequences of common and specific bands in PCR-DGGE profiles

3.3 不同纖維素富集培養(yǎng)條件下共性和特異性瘤胃菌群分析

孔慶亮等［20］應(yīng)用PCR-16S rDNA鑒定和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)奶牛瘤胃菌群，鑒定出具有代表性的細(xì)菌為牛鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和嗜熱鏈球菌。同樣，本研究在不同纖維素富集培養(yǎng)條件下鑒定出的瘤胃優(yōu)勢(shì)菌為解沒(méi)食子酸鏈球菌和解脲芽孢桿菌。Kakimoto等［21］通過(guò)微生物純培養(yǎng)方法鑒定了瘤胃內(nèi)的產(chǎn)脲酶菌主要是鏈球菌屬(Streptococcus)。本試驗(yàn)通過(guò)CMC培養(yǎng)基培養(yǎng)后的特異性條帶鑒定為產(chǎn)堿桿菌，可能是因?yàn)镃MC培養(yǎng)基中含有的酵母粉為微生物的生長(zhǎng)提供了充足的氮源及維生素等原料。而含豐富纖維素物質(zhì)的J培養(yǎng)基培養(yǎng)后的特異性條帶鑒定為未培養(yǎng)毛螺旋菌。Ghali等［22］從單峰駱駝和黑鹿中均鑒定出牛鏈球菌，而本試驗(yàn)從富含蛋白胨的PCS培養(yǎng)基培養(yǎng)后的特異性條帶鑒定為解沒(méi)食子酸鏈球菌，與其為同一屬。目前隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的瘤胃細(xì)菌信息被人們掌握，但研究發(fā)現(xiàn)瘤胃中仍有89%的細(xì)菌未被分離培養(yǎng)［7］，大量有價(jià)值的瘤胃細(xì)菌還有待探究。

4 結(jié)論

①不同纖維素富集培養(yǎng)基和溫度對(duì)瘤胃菌群的多樣性有一定程度上的影響。

②37℃條件下的瘤胃菌群多樣性高于50℃，50℃條件下可分離培養(yǎng)耐高溫細(xì)菌，如耐高溫解脲芽孢桿菌。

③不同培養(yǎng)基得到的瘤胃菌群存在一定差異，采用J培養(yǎng)基培養(yǎng)的瘤胃菌群多樣性程度低，但可作為分離某些難培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基，如未培養(yǎng)毛螺旋菌。

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