化學(xué)反應(yīng)法在活性氧測(cè)定中的應(yīng)用及研究進(jìn)展

鄒 軼 彭 健

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，武漢 430070)

正常的生理環(huán)境下，由于線粒體內(nèi)氧化還原鏈的作用，占體內(nèi)總耗氧量2%的氧氣轉(zhuǎn)化成超氧化陰離子自由基(·)和一氧化氮自由基(NO·)等 活 性 氧 (reactive oxygen species，ROS)［1］，由于體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的作用，機(jī)體產(chǎn)生的ROS可被及時(shí)地清除。ROS在體內(nèi)維持生成和降解的動(dòng)態(tài)平衡，從而保證機(jī)體的正常生理功能［2］。當(dāng)機(jī)體遭受感染、應(yīng)激、過(guò)度的運(yùn)動(dòng)、有害的環(huán)境污染物、紫外光照等時(shí)，·、NO·、羥自由基(·OH)、烷氧自由基(RO·)、氫過(guò)氧化物自由基(ROOH·)、單態(tài)氧()、碳酸鹽負(fù)離子自由基(·)和過(guò)氧化氫(H2O2)等ROS在體內(nèi)所占比例大幅提升［3］。當(dāng)ROS在體內(nèi)生成過(guò)多或清除過(guò)程受阻時(shí)，其數(shù)量快速增加，形成累積時(shí)高氧化活性的ROS會(huì)對(duì)體內(nèi)生物大分子，如DNA、碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類發(fā)生氧化反應(yīng)，對(duì)機(jī)體造成氧化損傷［1］。由于ROS對(duì)機(jī)體的氧化損傷在疾病和衰老中扮演了重要的角色［4］，因此，ROS在醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注。對(duì)于直接影響機(jī)體的ROS，由于ROS具有壽命短、反應(yīng)活性高(表1)的特點(diǎn)，對(duì)于ROS的準(zhǔn)確測(cè)定仍然很困難［5-6］。因此，簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、敏感且經(jīng)濟(jì)有效的ROS測(cè)定方法在現(xiàn)代自由基分子生物學(xué)中具有重要的意義。根據(jù)ROS的理化特性，目前用于ROS測(cè)定的主要方法有化學(xué)反應(yīng)法、捕捉法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法、高效液相色譜(HPLC)法、氣相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法、免疫印跡法、電洗脫法、等電聚焦法、伏安法等［7-9］。其中，化學(xué)反應(yīng)法由于其具有靈敏度高、廉價(jià)和操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，越來(lái)越廣泛的被用于生物反應(yīng)中ROS的測(cè)定?；瘜W(xué)反應(yīng)法是指由于ROS具有較高的反應(yīng)活性，能夠與許多不同的化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生各種不同的反應(yīng)生成物。根據(jù)這些反應(yīng)生成物或反應(yīng)物的變化程度，通過(guò)不同的分析儀器進(jìn)行檢測(cè)，就可以對(duì)ROS進(jìn)行定量或者定性分析［10］。目前主要的化學(xué)反應(yīng)法有分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、熒光光度法和電子自旋共振(ESR)法。

表1 主要活性氧的半衰期Table 1 Half-life of major ROS

1 分光光度法

分光光度法是通過(guò)測(cè)定ROS與顯色劑發(fā)生反應(yīng)，在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)光的吸光度或發(fā)光強(qiáng)度的變化，對(duì)該ROS進(jìn)行定性和定量分析的方法。由于分光光度法操作簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜，在實(shí)驗(yàn)室中受到廣泛的應(yīng)用。目前，ROS分光光度法測(cè)定中最常用的為細(xì)胞色素C(cytochrome C)還原法和硝基四氮唑藍(lán)(nitro blue tetrazolium，NBT)還原法。

細(xì)胞色素C還原法指高鐵細(xì)胞色素C能同氧自由基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，高鐵細(xì)胞色素C被還原為亞鐵細(xì)胞色素C，在分光光度計(jì)550 nm處吸光度增加，由此確定待測(cè)樣品中ROS的水平［11］。細(xì)胞色素C還原法雖然是一種有效的ROS測(cè)定方法，但是易受到細(xì)胞內(nèi)氧化酶和還原酶的影響［12］。當(dāng)測(cè)定ROS產(chǎn)生較低的血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，吸光度的測(cè)定、重量的稱取以及加樣量多少等誤差的存在，均可以放大結(jié)果的差異性，造成測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性降低［13］。此外，由于細(xì)胞色素C具有能被細(xì)胞內(nèi)氧化酶氧化以及分子質(zhì)量大不易于進(jìn)入細(xì)胞的特點(diǎn)，也限制了細(xì)胞色素C還原法在細(xì)胞試驗(yàn)中的應(yīng)用［13］。

2 化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光法指在沒有任何光、電、熱的作用下，基態(tài)分子吸收化學(xué)反應(yīng)放出的化學(xué)能躍遷到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子以光輻射的形式返回基態(tài)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。ROS是一類不穩(wěn)定的化合物，且具有很高的氧化活性，能夠與多種化合物發(fā)生氧化還原反應(yīng)。當(dāng)其同化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)時(shí)，發(fā)光試劑會(huì)迅速分解釋放光子，可以根據(jù)由此產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度對(duì)ROS進(jìn)行定量或者定性分析［10］。化學(xué)發(fā)光法由于具有敏感、測(cè)定范圍廣泛、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、安全和可控的特點(diǎn)，是目前運(yùn)用最為廣泛的ROS測(cè)定方法。在一定條件下，ROS能和魯米諾(luminol;5-amino-2，3-dihydrophthalazine-1，4-dione)、光澤精(lueigenin;N，N’-dimethyl-9，9’-diacridinum)和 腸 腔 素 {coelenterazine;2-(4-hydroxybenzyl)-6-(4-hydroxyphenyl)-8-benzyl-3，7-dihydroimi-dazo［1，2-α］pyrazin-3-one}及其類似物等化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)，產(chǎn)生不同強(qiáng)度、不同發(fā)射波長(zhǎng)的化學(xué)發(fā)光輻射。下面將分別介紹不同發(fā)光劑在ROS定量和定性分析研究中的應(yīng)用進(jìn)展。

魯米諾是化學(xué)發(fā)光研究中最常用的試劑之一，由于其具有靈敏、方便、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，對(duì)魯米諾的研究與應(yīng)用都很廣泛。在堿性環(huán)境中，魯米諾在催化劑(酶、過(guò)渡金屬離子或金屬絡(luò)合物)的催化下可與·OH、·以及H2O2等發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，迅速分解發(fā)光，其發(fā)光強(qiáng)度可由化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)。因此，魯米諾化學(xué)發(fā)光法可以應(yīng)用于·OH、·、和 H2O2等 ROS的測(cè)定［17］。利用魯米諾化學(xué)發(fā)光法對(duì)ROS進(jìn)行檢測(cè)具有以下幾個(gè)優(yōu)勢(shì):1)魯米諾能夠與體內(nèi)多種ROS發(fā)生反應(yīng)，沒有選擇特異性;2)魯米諾作為一種發(fā)光劑，可同時(shí)用于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外ROS水平的檢測(cè);3)由于體內(nèi)多種關(guān)鍵自由基，如·OH、·的半衰期非常短，而魯米諾能夠與其迅速反應(yīng)［18］。目前魯米諾化學(xué)發(fā)光法已被用于精子與精清［19］、血液與組織勻漿上清液［20］、細(xì)胞［21］等樣品中ROS的檢測(cè)。然而，由于·OH、·和H2O2這些ROS物質(zhì)均能夠氧化魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，很難用于其中單一ROS物質(zhì)的直接測(cè)定［22］。因此，在很多情況下，ROS的魯米諾化學(xué)發(fā)光法只能作為定量或者定性分析的輔助手段。

光澤精同魯米諾一樣，也是一種廣泛使用的化學(xué)發(fā)光劑。1935年，Glue等［23］最先報(bào)道了有關(guān)光澤精化學(xué)發(fā)光的文章。與魯米諾相比，光澤精具有以下優(yōu)點(diǎn):1)光澤精的發(fā)光體N-甲基叮淀酮比魯米諾的發(fā)光體3-氨基鄰苯二甲酸發(fā)光更強(qiáng)、發(fā)光效率更高。2)光澤精的化學(xué)發(fā)光對(duì)某些還原劑非常敏感。3)含α-羥羰基的化合物與光澤精會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈的化學(xué)反應(yīng)［24］。4)光澤精化學(xué)發(fā)光法只對(duì)·和H2O2敏感，特異性相對(duì)比較高。而當(dāng)只存在·OH時(shí)，其并不能夠激發(fā)光澤精發(fā)光［25］。但是光澤精自身能夠與氧氣(O2)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生自由基·，當(dāng)生物體系統(tǒng)·水平很低，而光澤精濃度較高時(shí)，由光澤精氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生·的比例可能要大于生物所含有的·，影響光澤精化學(xué)發(fā)光法測(cè)定ROS的準(zhǔn)確度［26-27］。此外，光澤精主要用于胞外自由基的檢測(cè)［28］。

由于魯米諾和光澤精都不是特異性的化學(xué)發(fā)光劑，均能與多種ROS發(fā)生反應(yīng)。而另一種親脂性化學(xué)發(fā)光劑腸腔素及其類似物CLA(2-methyl-6-phenyl-3，7-dihydroimidazo［1，2-α］-pyrazin-3-one)和 MCLA{2-methyl-6-(4-methoxyphenyl)-3，7-dihydroimidazo［1，2-α］pyrazin-3-one}開始運(yùn)用于·的測(cè)定。腸腔素是從腸腔類水生動(dòng)物體內(nèi)分離出來(lái)的一種親脂性發(fā)光基團(tuán)，在ROS中，其對(duì)·具有特異性［29］，·能夠氧化腸腔素中的乙酰氨基吡啶陰離子，分解釋放出光子［30］。由于腸腔素發(fā)光體乙酰氨基吡啶比光澤精和魯米諾的發(fā)光更強(qiáng)，并且不會(huì)同O2發(fā)生氧化還原反應(yīng)［31］，穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性更高。因此，依賴于腸腔素的化學(xué)發(fā)光法已經(jīng)被研究者運(yùn)用于培養(yǎng)的細(xì)胞［32］、嗜中性粒細(xì)胞［33］、血管組織［30］和線粒體［34］中·的測(cè)定。CLA和MCLA作為腸腔素的類似物，具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，同樣對(duì)于·具有特異性和敏感性，已經(jīng)被用于不同樣品中·的測(cè)定，包括嗜中性粒細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞［35］、內(nèi)皮細(xì)胞［36］和血管組織［37］等。值得注意的是，MCLA 作為一種化學(xué)發(fā)光試劑，在對(duì)肝臟［38］、腸道［39］、心臟［40］、肺臟［33］和血管組織［41］等機(jī)體組織表面ROS水平的測(cè)定已有報(bào)道。雖然腸腔素對(duì)于·具有特異性，但是過(guò)氧亞硝酸陰離子(ONOO-)同樣能夠誘導(dǎo)腸腔素化學(xué)發(fā)光［34］。因此，在特異性鑒定·的時(shí)候，活性氮抑制劑的選擇，如 ONOO-清除劑的應(yīng)用，可以減少由于ONOO-對(duì)總化學(xué)發(fā)光的影響所產(chǎn)生的誤差，增加測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。不同化學(xué)發(fā)光劑的作用特點(diǎn)見表2。

表2 不同化學(xué)發(fā)光劑的作用特點(diǎn)Table 2 Action characteristic of different chemiluminescence agents

3 熒光光度法

熒光光度法是通過(guò)合適的熒光探針作用于細(xì)胞，在與ROS發(fā)生反應(yīng)后，探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，生成具有強(qiáng)熒光的產(chǎn)物，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度可在一定程度上反映ROS水平。熒光光度法由于其具有高細(xì)胞膜穿透性、高分辨率、高靈敏度、可提供細(xì)胞內(nèi)靶分子時(shí)空信息的特點(diǎn)，在ROS的測(cè)定中得到廣泛應(yīng)用［42-43］。不同的熒光探針，根據(jù)其作用特異性對(duì)象的不同和激發(fā)波長(zhǎng)及發(fā)射波長(zhǎng)的不同，可測(cè)定不同的ROS水平(圖3)。目前應(yīng)用最廣泛的熒光探針主要有二氯熒光素(2，7-dichlorodihydrofluorescein，DCFH)、二氫羅丹明123(dihydrorhodamine 123，DHR)和氫化乙啡啶(hydroethidine，HE)等。

DCFH能夠氧化生成強(qiáng)熒光化合物二氯熒光黃(2，7-dichlorofluorescein，DCF)，其雙乙酸鹽形式2，7-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)是一種激發(fā)波長(zhǎng)為498 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為522 nm的熒光染料。由于DCFH-DA極易透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)［44］，在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解為水溶性的DCFH，該物質(zhì)能夠被·OH、ROOH··、H2O2和NO·等多種ROS所氧化，因此被廣泛的運(yùn)用于細(xì)胞內(nèi)ROS的測(cè)定［45-46］。雖然，DCFH法能夠準(zhǔn)確、方便地測(cè)定總ROS的水平，但是其特異性較差。有研究者發(fā)現(xiàn)使用DCFH對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)行測(cè)定時(shí)，DCFH有可能被機(jī)體內(nèi)的高鐵離子、細(xì)胞色素C、腺嘌呤氧化酶所氧化，致使DCF的含量增加而影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性［47-48］。此外，高濃度的DCFH可產(chǎn)生細(xì)胞毒性，影響測(cè)定結(jié)果［49］。

DHR是一種非熒光分子，DHR與ROS反應(yīng)后生成具有熒光的脂溶性探針羅丹明123，其激發(fā)波長(zhǎng)為505 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為529 nm，由于DHR具有親脂性，其極易擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞膜［53］。雖然DHR主要用于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)H2O2的水平，但是其特異性較低，能夠被多種ROS和氧化物如ONOO-、高鐵離子、細(xì)胞色素C、次氯酸(HClO)和腺嘌呤氧化酶所氧化［45，48］。

不同熒光探針的作用特點(diǎn)見表3。

表3 不同熒光探針的作用特點(diǎn)Table 3 Action characteristic of different fluorescence probes

4 ESR法

ESR是指由于不同自由基結(jié)構(gòu)具有特定的核自旋能量，其在穩(wěn)定的磁場(chǎng)作用下，同電磁輻射能相互作用而產(chǎn)生的共振吸收現(xiàn)象。通過(guò)對(duì)共振譜線的研究可以獲得對(duì)自由基未偶電子的狀態(tài)及其周圍環(huán)境方面的信息，從而得到有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵的信息，以此來(lái)鑒定不同自由基的種類和水平［54］。ESR法雖然是目前ROS測(cè)定的最直接和有效的方法，但是其應(yīng)用依然受到幾個(gè)方面的限制，其中最主要的限制因素是由于ESR每次掃描都需要幾秒的時(shí)間，而主要的ROS如O-2·和·OH等，由于其在生物體系中有濃度低且存活時(shí)間短的特點(diǎn)，因而不易被 ESR法所測(cè)定［27］。因此，應(yīng)用ESR法測(cè)定存活時(shí)間短的ROS時(shí)，可以通過(guò)電子自旋共振探針試劑與ROS的相互作用，捕捉ROS，通過(guò)二級(jí)產(chǎn)物來(lái)間接測(cè)定［55-56］。電子自旋共振試劑苯基-叔丁基硝酸(PBN)和5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物(DMPO)能夠同ROS發(fā)生反應(yīng)，生成包含亞硝基或硝酮的穩(wěn)定化合物，而引起信號(hào)的變化，以此來(lái)測(cè)定ROS的種類和水平［57-58］。但是，電子順磁共振譜儀是相當(dāng)昂貴且對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求嚴(yán)格的試驗(yàn)儀器，限制了ESR法在普通實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用性。

5 小結(jié)

由于ROS在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域的重要性，根據(jù)特定的試驗(yàn)?zāi)康倪x擇靈敏、準(zhǔn)確、特異性高、穩(wěn)定性好和操作簡(jiǎn)單的ROS測(cè)定方法，在現(xiàn)代自由基生物學(xué)研究中具有重要的意義。但是ROS由于其反應(yīng)活性高、壽命短、積累水平低，加之種類較多的特點(diǎn)，很難被直接準(zhǔn)確測(cè)定?；瘜W(xué)反應(yīng)法作為目前應(yīng)用最為廣泛的ROS檢測(cè)方法，主要有化學(xué)發(fā)光法、分光光度法、熒光光度法和ESR法這4個(gè)體系。研究者針對(duì)不同的ROS和不同的樣品時(shí)，都可以從化學(xué)反應(yīng)法中選出適宜的方法進(jìn)行測(cè)定。但化學(xué)反應(yīng)法由于受化學(xué)反應(yīng)物理化特性的影響，大多特異性較低、易受環(huán)境影響、穩(wěn)定性較差。因此，在對(duì)ROS進(jìn)行測(cè)定時(shí)，需通過(guò)對(duì)待測(cè)樣品的性質(zhì)、類型以及ROS的種類進(jìn)行判斷，選擇適宜的測(cè)定方法，以利于得出準(zhǔn)確的結(jié)果。此外，毒性低、穩(wěn)定性好、特異性高的新型化合物的發(fā)現(xiàn)及合成也為未來(lái)化學(xué)發(fā)光法更廣泛的應(yīng)用和發(fā)展提供了基礎(chǔ)和方向。

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