豬原發(fā)性心肌癥相關(guān)蛋白1基因的多態(tài)性分析

田亞光，鄭 鵬，黃 賀，楊秀芹

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030）

原發(fā)性心肌癥相關(guān)蛋白1（Cardiomyopathy-as?sociated protein 1,CMYA1）基因最早通過mRNA差異顯示技術(shù)在雞胚的房室溝中發(fā)現(xiàn)，又命名為XIRP1或Xin基因[1]。利用原位雜交、Northern blot和Western blot雜交技術(shù)在mRNA和蛋白水平上研究發(fā)現(xiàn)，該基因是骨骼肌特異表達(dá)基因，其編碼產(chǎn)物位于成年動(dòng)物心臟閏盤的連接處，可能參與心臟閏盤的形成及維持肌原纖維的完整性[1-2]。CMYA1能夠結(jié)合肌動(dòng)蛋白絲，并組織微絲成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[3]。小鼠Xinα基因敲除后表現(xiàn)為心臟肥大，超顯微結(jié)構(gòu)顯示心臟閏盤處具有明顯的分裂及肌纖維肌絲紊亂[4]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Xin與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和細(xì)胞骨架重塑有關(guān)[3、5]，參與BMP2-Nkx2.5-MEF2C通路來調(diào)控心臟形態(tài)變化[2-4]。Hawke等研究發(fā)現(xiàn)，作為一種肌動(dòng)蛋白，Xin轉(zhuǎn)錄量在肌肉受損后的12 h急劇增加（大于16倍）[6]。因此，CMYA1與心肌和骨骼肌生長發(fā)育密切相關(guān)。

不同物種CMYA1蛋白都含有5個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，分別為富含脯氨酸的區(qū)域、16個(gè)氨基酸的重復(fù)序列（又叫Xin重復(fù)序列）、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)基序和核定位信號。豬CMYA1基因由2個(gè)外顯子組成，編碼區(qū)全長5 420 bp，預(yù)期編碼1 839個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈，定位在13號染色體上[7]。通過比對豬QTL數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)CMYA1可能與豬平均背膘厚、第一肋骨處背膘厚、平均日增重、腿臀重以及屠宰率等性狀有關(guān)。許曉玲等研究認(rèn)為豬CMYA1基因與背膘厚存在顯著相關(guān)[8]，但孫泰雷等在13/17羅伯遜異位雜合子豬中的研究卻未得到相同結(jié)果[9]。本研究以豬CMYA1基因編碼區(qū)存在的3個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)c.1394A＞G（p.His465 Arg）、c.1751A＞G（p.Asp582Gly）和 c.3290C＞A（p.Thr1097Asp）為研究對象，利用PCR-RFLP方法研究不同基因型在北京黑豬、丹系長白豬、大白豬和法系長白豬4個(gè)品種中的分布情況，為進(jìn)一步揭示CMYA1基因與生長和胴體性狀間關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織樣和DNA提取

采集191頭豬的耳組織樣，其中北京黑豬（39頭）和法系長白豬（31頭）采自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院豬場，大白豬（53頭）和丹系長白豬（68頭）來自哈爾濱香坊豬場。利用酚-氯仿法提取基因組DNA[9]。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank提供的豬CMYA1基因mRNA序列（No.EF173403），針對3個(gè)待研究的變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，為后續(xù)利用PCR-RFLP方法進(jìn)行變異位點(diǎn)檢測和基因分型提供條件。引物序列及擴(kuò)增條件見表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增條件Table1 Primer sequences and amplification conditions

1.3 基因型檢測

PCR擴(kuò)增條件：15 μL的反應(yīng)體系中包括10×PCR buffer 1.5 μL、dNTPs mix 0.6 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）各0.6 μL、rTaq DNA聚合酶 1 U、模板DNA 50 ng。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min后，95℃變性30 s，60.4℃/63℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)33次，72℃終延伸5 min。

對不同突變位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物分別用NcoI（c.1394A＞G）、HaeⅢ（c.1751A＞G）和RsaI（c.3290 C＞A）進(jìn)行酶切。

酶切體系、反應(yīng)時(shí)間及產(chǎn)物檢測參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行，酶切溫度按照說明書要求設(shè)置。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS軟件進(jìn)行χ2獨(dú)立性和適合性檢驗(yàn)，用PIC-Calc 0.6軟件進(jìn)行多態(tài)信息含量（Polymor?phism information content,PIC）計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-RFLP結(jié)果統(tǒng)計(jì)

針對3個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物分別成功擴(kuò)增出特異性很好的PCR產(chǎn)物，酶切后都得到多態(tài)性條帶。其中，c.1394A＞G位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物酶切后得到514 bp、514 bp/347 bp/167 bp和347 bp/167 bp 3種帶型，分別命名為AA、AB和BB基因型；c.1751A＞G位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物酶切后得到319 bp、319 bp/212 bp/107 bp和212 bp/107 bp 3種帶型，分別命名為AA、AB和BB基因型；c.3290C＞A位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物酶切后得到286 bp、286 bp/132 bp/154 bp和132 bp/154 bp 3種帶型，分別命名為AA、AB和BB基因型。各位點(diǎn)在不同品種中的檢測結(jié)果見表2。

2.2 統(tǒng)計(jì)參數(shù)計(jì)算

根據(jù)PCR-RFLP統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算得到3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的純合度、雜合度、多態(tài)信息含量等統(tǒng)計(jì)參數(shù)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)c.1394A＞G和c.1751A＞G都屬于中度多態(tài)位點(diǎn)（0.24＜PIC＜0.5）（見表3）。

表3 豬CMYA1基因3個(gè)位點(diǎn)群體遺傳學(xué)分析Table3 Statistic values of 3 polymorphic loci of pig CMYA1 gene

2.3 適合性檢驗(yàn)

χ2適合性檢驗(yàn)表明，在c.1394A＞G多態(tài)位點(diǎn)，所檢測的4個(gè)群體中基因型的分布都符合Hardy-Weinberg平衡定律；在c.1751 A＞G多態(tài)位點(diǎn)，只有北京黑豬是Hardy-Weinberg平衡群體；在c.3290 C＞A多態(tài)位點(diǎn)，基因型在北京黑豬中的分布不符合Hardy-Weinberg平衡定律（見表4）。

表4 哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)結(jié)果Table4 Result of Hardy-Weinberg equilibrium test

2.4 獨(dú)立性檢驗(yàn)

χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)表明在各多態(tài)位點(diǎn)，基因型在品種間的分布都存在顯著差異（P＜0.05），各基因型在品種間分布情況的多重比較結(jié)果見表5。

表5 不同位點(diǎn)在各品種（系）間基因型分布的多重比較結(jié)果Table5 Multiple comparisons of individual genotypes of 3 polymorphic sites among breeds(lines)

3 討論與結(jié)論

我國是豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)大國，豬肉消費(fèi)量占全球一半。上世紀(jì)九十年代以前，豬遺傳育種以改良生長繁育為主要目標(biāo)；現(xiàn)階段豬的育種目標(biāo)不但追求良好的生長繁育性狀，還要提高豬的抗病能力。

許曉玲等在獲得杜洛克和二花臉豬背最長肌差異表達(dá)EST基礎(chǔ)上，克隆獲得CMYA1基因[8]。劉榜等在伯克夏與約克夏雜交群體中確定CMYA1基因與豬的背膘厚存在顯著相關(guān)，是一個(gè)與背膘厚相關(guān)的QTL[7]。另外，CMYA1蛋白與心肌發(fā)育和形態(tài)變化有關(guān)，可以促進(jìn)閏盤器的成熟和穩(wěn)定，保證心臟正常功能[4]；在構(gòu)建心肌肥厚和高血壓動(dòng)物模型中，Xin蛋白顯著上調(diào)表達(dá)[11]；Julia等[12]在人類心臟組織中檢測XinC蛋白表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其僅在心肌肥厚患者的樣本中存在；這些都說明該基因與心血管疾病發(fā)生存在著相關(guān)性。因此，對豬CMYA1基因的研究，不但在生長和胴體性狀上有潛在應(yīng)用價(jià)值，也有可能與豬抗病育種相聯(lián)系。

CMYA1基因在哺乳動(dòng)物中高度保守，人CMYA1基因編碼1 843個(gè)氨基酸，牛CMYA1基因編碼1 820個(gè)氨基酸。豬CMYA1基因的核苷酸序列與人和牛相應(yīng)序列相似性都為87%，氨基酸水平上的相似性則分別為83%和78%。本研究所檢測的3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中，c.1394A＞G（p.His465Arg）和c.1751 A＞G（p.Asp582Gly）位點(diǎn)緊鄰16個(gè)氨基酸的重復(fù)序列（見圖1）。

圖1 2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在氨基酸序列上的位置及同源性比對Fig.1 Positions and homology analysis of the 2 out of 3 polymorphic sites

16個(gè)氨基酸重復(fù)序列是肌動(dòng)蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域[6、13]，并參與組建細(xì)胞骨架的微絲網(wǎng)絡(luò)[14]。此外，c.1751 A＞G（p.Asp582Gly） 在人、豬、狗、牛、獼猴、小鼠等物種中高度保守（見圖1），這兩個(gè)位點(diǎn)變異可能會(huì)對CMYA1功能產(chǎn)生一定影響。

c.1394A＞G（p.His465Arg）和 c.1751A＞G（p.Asp582Gly）2個(gè)點(diǎn)突變在大白、丹系長白、法系長白和北京黑豬中的分布存在極顯著差異，并且發(fā)生頻率較高（＞5%）；結(jié)合同源性和結(jié)構(gòu)功能域分析結(jié)果，該突變具有作為遺傳標(biāo)記的潛在可能性。

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