PTK787對K562細胞增殖及細胞周期作用的影響*

姜杉 陳日玲 邸曉華 劉曉利 田川

酪氨酸激酶（PTKs）是一種新型血管內(nèi)皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，通過抑制酪氨酸激酶的磷酸化，阻斷信號傳導、酪氨酸激酶的過度激活導致其下游信號途徑的激活，最終導致細胞的轉化、增殖和抵抗細胞凋亡、促進細胞生存，進而與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預后與轉歸密切相關。其抑制劑中的一種PTK787可抑制多種實體腫瘤細胞的生長，已有研究表明PTK787有抗急性髓系白血病的作用[1]。本實驗利用PTK787作用于K562細胞，研究其對K562細胞增殖、細胞周期的作用，以進一步探討PTK787抗白血病細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人慢性粒細胞白血病急變期K562細胞株，購于中國科學院上海細胞庫。酪氨酸激酶抑制劑PTK787由瑞士諾華公司惠贈。MTT購于美國Sigma公司。RT-PCR試劑盒、RNA提取試劑盒購于Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) K562細胞在含10%小牛血清，100μmol/L的青、鏈霉素的RPM1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于各項實驗。

1.2.2 PTK787對K562細胞增殖作用的細胞形態(tài)學觀察 使用分別加入10 μl不同濃度的PTK787作用K562細胞48 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長變化情況，并拍照。

1.2.3 MTT法檢測PTK787對K562細胞的增殖作用 取對數(shù)生長期、生長良好的白血病K562細胞用于實驗，調(diào)整各組細胞濃度為1×104個/ml，每組設3個復孔。各實驗組加入含10 μl不同濃度PTK787的細胞培養(yǎng)液。接種完畢后在37 ℃，5%CO2條件下孵育培養(yǎng)12、36、48、72 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）10 μl，混勻后37 ℃，5% CO2條件下孵育4 h，加入三聯(lián)細胞裂解液（SDS 10 g，異丁醇5 ml，10M HCl 0.1 ml用雙蒸水溶解配成100 ml溶液）100 μ l，37 ℃溫育12～20 h，用丹尼酶標儀檢測各組細胞的吸光度，測定波長為570 nm。細胞抑制率=1-（實驗組光密度-空白對照組光密度）/（陰性對照組光密度-空白對照組光密度）×100%。

1.2.4 流式細胞儀檢測PTK787對K562細胞周期作用 6孔板每孔加入等量細胞以及10 μl不同濃度的PTK787，培養(yǎng)48 h，冷PBS洗滌離心2次，棄PBS。用70%冰乙醇固定12 h，調(diào)整細胞濃度1×106個/ml；用冷PBS洗滌2次，棄PBS。加入PI染液0.6 ml，避光染色半小時后上流式細胞儀檢測。打印DNA含量直方圖，自動擬合細胞周期各時相比例。重復5次。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用SPASS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計描述，本實驗數(shù)據(jù)資料以（±s）表示，多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，多個樣本均數(shù)間每兩個均數(shù)的比較根據(jù)方差齊性檢驗，當總體方差齊同時選擇LSD法；當總體方差不齊時，選擇Tamhane T2法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PTK787對K562細胞增殖作用情況的細胞形態(tài)學觀察 以下為不用濃度PTK787作用K562細胞48 h后相差顯微鏡下細胞生長變化圖。陰性對照組為生長48 h的K562細胞：細胞生長旺盛，形態(tài)規(guī)則，密集平鋪在培養(yǎng)板。加入不同濃度的PTK787作用細胞48 h，且藥物濃度逐漸升高，發(fā)現(xiàn)細胞生長明顯受抑制，細胞數(shù)量、形態(tài)均有改變，呈濃度相關性。見圖1。

圖1 不用濃度PTK787作用K562細胞48 h后相差顯微鏡下細胞生長變化圖

2.2 PTK787對K562細胞增殖的作用 不同濃度的PTK787作用于K562細胞12、36、48、72 h后，用MTT法檢測結果見表1。表明PTK787對K562細胞有明顯的抑制作用。隨著PTK787濃度增加與作用時間延長，K562的增殖抑制率逐漸升高。同一時間不同濃度組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。同一濃度不同時間組之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示PTK787作用48 h，濃度為320 μmol/L對細胞抑制最明顯。繼續(xù)增加濃度或延長作用時間抑制率增加不明顯。（圖1）。

2.3 PTK787對K562細胞周期的作用 流式細胞儀檢測細胞周期表明，PTK787顯著改變G1期與S期細胞比例。加入20、40、80、160、320 μmol/L PTK787的細胞組分別與陰性對照組相比較，G1期細胞比率均高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。G1期細胞組與S期細胞組各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但是PTK787濃度由160 μmol/L繼續(xù)升高時，G1期與S其細胞比率改變不明顯。提示PTK787抑制腫瘤細胞增殖的機制可能與減慢G1/S期的轉換有關。見表2。

表1 PTK787對K562細胞的增殖抑制率 %

表2 流式細胞儀檢測不同處理組K562細胞各周期的細胞比率

3 討論

蛋白酪氨酸激酶按其結構可分為受體酪氨酸激酶（receptor protein tyrosine kinases，RTKs）和非受體酪氨酸激酶（non-receptor protein tyrosine kinases，nrPTKs）[2]。PTK787/ZK222584是一種新型血管內(nèi)皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑。國外研究發(fā)現(xiàn)，PTK787可抑制多種實體腫瘤細胞的生長[3-5]，研究表明PTK787有抗急性髓系白血病的作用[6]。酪氨酸激酶在腫瘤形成過程中起著重要作用，這一方面究已經(jīng)取得很多進展。酪氨酸激酶功能的失調(diào)，會導下游信號途徑激活，引起細胞增殖調(diào)節(jié)紊亂，最終導致腫瘤形成[7]。本實驗通過研究不同濃度PTK787作用于K562細胞后，觀察對細胞增殖，細胞周期作用的影響。結果表明，PTK787具有明顯抗白血病作用，主要表現(xiàn)在：（1）抑制K562細胞增殖，藥物濃度從20 μmol/L升高到320 μmol/L，細胞的增殖抑制率明顯升高（P<0.05），其中藥物濃度以320 μmol/L，作用時間為48 h時細胞的抑制率最高。繼續(xù)提高藥物濃度和延長藥物作用時間細胞抑制無明顯改變；（2）阻止K562細胞周期G1期想S期轉換；S期是細胞周期的關鍵時刻，DNA復制、蛋白合成均在S期，所以S期細胞數(shù)目降低表明細胞增殖受到抑制。

PTK787對K562細胞的生長抑制機理可能為：（1）PTK787可抑制所有已知的VEGFR酪氨酸激酶。通過與VEGFR上的三磷酸腺苷結合位點競爭性結合，抑制VEGF介導的信號傳導通路，阻斷新生血管的形成而抑制腫瘤的生長[8]。藥物尼羅替STI571為作用于該類受體的酪氨酸激酶抑制劑。體外研究表明，STI571可降低CML細胞系的K562細胞系和KU812F細胞系以及表達野生型BCR-ABL的前B細胞系Ba/F3的BCR-ABL自主磷酸化，抑制細胞增殖[9]。（2）通過下調(diào)Bcl-2和Bcl-xL的表達誘導腫瘤細胞凋亡增加。（3）作用于腫瘤細胞生長周期的G1期、部分G2/M期，從而抑制腫瘤細胞生長[10]。（4）PTK787可下調(diào)白血病細胞FAK基因的表達，而FAK類似于癌基因的作用。從而達到抗腫瘤的作用。（5）PTK787可能通過糾正ph（﹢）CML細胞異常蛋白表達，使細胞恢復正常生長狀態(tài)。以往的抗腫瘤藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，對機體正常的組織細胞也有殺傷作用。隨著分子生物學技術的發(fā)展和從細胞受體與增殖調(diào)控的分子水平對腫瘤發(fā)病機制認識的進一步深入，針對細胞受體、關鍵基因和調(diào)控分子為靶點的治療開始進入臨床，人們稱其為“分子靶向治療”。臨床的酪氨酸激酶抑制劑的抗腫瘤作用機制可能是通過抑制腫瘤細胞的損傷修復、使細胞分裂阻滯在G1期、誘導和維持細胞凋亡、抗新生血管形成等途徑實現(xiàn)。分子靶向對抗腫瘤細胞不僅對腫瘤細胞有很強的殺傷力，并且可使正常細胞免受損害，可大大減少化療的副作用。

最新研究進展表明，作為促使細胞通過G1/S期限制點的細胞周期蛋白Cyclin D1的表達失常與多種腫瘤的癌變相關。在轉基因動物中證明，Cyclin D1的變異參與了間變等癌變早期病理變化過程。酪氨酸激酶促進腫瘤細胞增殖的機制可能為增加細胞DNA合成和加快G1/S期的轉換。酪氨酸激酶是通過增加Cyclin D1的表達與抑制p21的協(xié)同作用來促進DNA合成的，應用酪氨酸激酶抑制劑可以阻斷這些過程[11]。這些結果均提示誘導酪氨酸激酶的表達對于細胞周期的調(diào)節(jié)是正性的，而Cyclin D1可能是酪氨酸激酶調(diào)節(jié)細胞周期的基本功能靶點，這為下一步的研究提供了理論基礎。

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