脊尾白蝦組織蛋白酶L基因的克隆及其表達分析

段亞飛，劉 萍，李吉濤，李 健，高保全，陳 萍

1. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；

2. 上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院, 上海 201306

脊尾白蝦 (Exopalaemon carinicauda)，是中國黃、渤海重要的底棲蝦類 (Liu，1955)。因其繁殖能力強、生長速度快及環(huán)境適應(yīng)性強等特點，養(yǎng)殖面積得到迅速擴大，成為我國近海重要的經(jīng)濟蝦類。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大及生態(tài)環(huán)境的不斷惡化，蝦類疾病頻繁發(fā)生，造成了嚴重的經(jīng)濟損失(Li et al，2012a；Xu et al，2010)。脊尾白蝦具有先天免疫防御功能，且其防御功能的發(fā)揮與免疫基因有關(guān)，因此發(fā)掘脊尾白蝦免疫基因并加強免疫機制研究顯得尤為重要。

組織蛋白酶L(cathepsin L，CatL)是半胱氨酸蛋白酶中木瓜蛋白酶C1家族的主要成員，廣泛存在于各種生物有機體中(Liu et al，2006；Zeng et al，2005)。它不僅參與生物體內(nèi)的各種蛋白水解，還參與抗原呈遞、組織再生、腫瘤入侵和轉(zhuǎn)移、骨質(zhì)吸收及細胞凋亡等重要生命活動(Dohchin et al，2000；Furuyama & Fujisawa，2000；Kos et al，2000；Lindeman et al，2004)。目前已見水產(chǎn)動物的組織蛋白酶L基因相關(guān)報道。組織蛋白酶L在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)(Zhao et al，2007)、中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)(Bu et al，2008)、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)(Li et al，2010)及紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)(Venier et al，2006)等水產(chǎn)動物免疫系統(tǒng)中均發(fā)揮重要作用，但其在脊尾白蝦中的研究尚未見報道。為深入了解組織蛋白酶L在脊尾白蝦中的免疫作用，本研究利用從本實驗室構(gòu)建的脊尾白蝦血細胞全長cDNA文庫中篩選得到的組織蛋白酶L基因EST序列，采用RACE技術(shù)，克隆得到該基因全長cDNA序列，并對其在鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus, WSSV)感染后的脊尾白蝦組織中的表達特征進行了初步研究，以期為脊尾白蝦組織蛋白酶L生物學功能研究及其對病原的抗病機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康脊尾白蝦取自青島膠州，體長(5.81±0.32)cm，體重(1.18±0.35) g。暫養(yǎng)于200 L的PVC桶中，每桶30尾，暫養(yǎng)一周。養(yǎng)殖水溫24 ℃，鹽度25，pH 8.2，持續(xù)充氧，每天換水1/3，投喂配合飼料。

TRIzol Reagent購自Invitrogen公司；SMARTTMRACE Amplification Kit和 Advantage 2 PCR Kit購自Clontech公司；DNA膠回收試劑盒購自上海生工公司；PMD18-T載體和大腸桿菌Top 10感受態(tài)細胞均購自 TaKaRa公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 總RNA提取及cDNA的合成

Trizol試劑提取血細胞總RNA，按照Invitrogen說明書進行；紫外分光光度計與1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量及完整性。

1.3 全長cDNA的克隆及測序

根據(jù)本實驗室已構(gòu)建的脊尾白蝦血細胞全長cDNA文庫，通過隨機測序獲得組織蛋白酶L基因的 EST序列，利用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計3'RACE和 5'RACE特異性引物，所有引物均由上海生工合成。

3'和 5'末端擴增使用 SMARTTMRACE Amplification Kit和 Advantage 2 PCR Kit進行。3'RACE使用引物CatL-F1 (表1)和通用引物UPM配對，進行3'端擴增；5'RACE使用引物CatL-R1 (表1)和通用引物 UPM，進行 5'端擴增。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5 個循環(huán)；94 ℃30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Sequence of study primers

3'和5'RACE擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒回收目的片段，與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top 10感受態(tài)細胞，陽性克隆經(jīng)菌落 PCR鑒定后，送往上海生工公司進行測序。

1.4 序列分析

利用DNAStar軟件中的SeqMan程序?qū)y序結(jié)果進行載體序列去除和序列拼接，然后用 EditSeq程序進行開放閱讀框(ORF)的預測和氨基酸翻譯。EcCatL基因的核苷酸序列和推導氨基酸序列使用BLAST(http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源性比對。利用 Protparam 軟件(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預測。利用 Interpro Scan軟件(http://www.ebi.ac.uk/Tool/InterProScan)進行蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析。使用Clustal X軟件對脊尾白蝦與其他物種的 CatL氨基酸序列進行多序列比對，在此基礎(chǔ)上采用 MEGA 4.0軟件，以鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 鰻弧菌和WSSV感染實驗

實驗用 WSSV粗提液為黃海水產(chǎn)研究所病研室所贈，方法見Li et al (2012b)。實驗用鰻弧菌為黃海水產(chǎn)研究所楊愛國實驗室所贈。實驗用鰻弧菌于實驗前一天進行菌種活化，經(jīng)2611E液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后離心取沉淀，用無菌生理鹽水稀釋為2×108pfu/mL的菌懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實驗前隨機挑取 10尾脊尾白蝦，經(jīng)白斑病毒綜合征檢測試劑盒檢測證實無WSSV感染。隨機選取暫養(yǎng)7 d的健康脊尾白蝦分為對照組、鰻弧菌感染組和WSSV感染組，每組50尾。鰻弧菌感染組在每尾蝦第二腹節(jié)部位注射鰻弧菌菌懸液20 μL，WSSV感染組在每尾蝦第二腹節(jié)部位注射WSSV粗提液20 μL，對照組注射等體積生理鹽水。各組分別于注射后0、3、6、12、24、48及72 h取血細胞和肝胰腺，用于RNA提取，每個時間點取6尾。此外，為檢測脊尾白蝦 EcCatL基因在不同組織中的表達水平，另取6尾健康脊尾白蝦的血細胞、鰓、肝胰腺、肌肉、卵巢、腸、胃和眼柄組織，用于RNA提取。

1.6 EcCatL基因表達分析

TRIzol試劑提取不同實驗組脊尾白蝦血細胞和肝胰腺組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，方法按Han et al (2011)進行。

根據(jù)已獲得的脊尾白蝦內(nèi)參基因18S rRNA和EcCatL基因全長序列，分別設(shè)計一對正反引物(18S rRNA-F/R及CatL-F2/R2)(表1)，利用Real-time PCR對不同時間鰻弧菌和 WSSV感染的脊尾白蝦血細胞和肝胰腺中EcCatL基因的表達量進行檢測。反應(yīng)體系為 20 μL，包括 10 μL SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (×2)，0.8 μL 10 μmol/L 引物 CatL-F2，0.8 μL 10μmol/L 引物 CatL-R2，0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ (×50)*3，2.0 μL cDNA，6.0 μL DEPC 水。反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。采用2-△△CT法計算EcCatL基因的表達量，用SPSS 11.0軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 EcCatL基因全長cDNA克隆

利用 Trizol試劑提取獲得脊尾白蝦血細胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測，其 OD260/OD280為1.91，表明總RNA純度較高；經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，18S和28S rRNA條帶清晰，完整性較好，符合實驗要求。以特異性引物CatL-F1和CatL-R1分別與通用引物UPM配對，進行3'RACE和5'RACE擴增，獲得～441和～500 bp的特異性條帶各一 (圖1)。

圖1 總RNA 和3'RACE、5'RACE擴增產(chǎn)物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析Figure 1 Analysis of total RNA and amplification products of 3', 5'RACE by 1.0% agarose gel electrophoresis

2.2 EcCatL基因全長cDNA序列特征分析

3'RACE和 5'RACE擴增產(chǎn)物分別測序后與EST序列進行拼接，獲得脊尾白蝦CatL基因的全長cDNA序列，命名為EcCatL，GenBank登錄號為JX508645。該基因全長1 136 bp，包括24 bp的5'端非編碼區(qū)(UTR)，152 bp的3'端非編碼區(qū)和960 bp的開放閱讀框。3'端含有多聚腺苷酸加尾信號AATAAA和PolyA尾 (圖2)。

圖2 脊尾白蝦EcCatL基因的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列Figure 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of E. carinicauda EcCatL gene

氨基酸序列分析可知，EcCatL基因編碼一個由319個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)域分析表明，其N端含有15個氨基酸組成的信號肽，成熟肽位于第15～319位氨基酸之間，分子量為35.30×103，理論等電點為5.27。結(jié)構(gòu)域分析表明，EcCatL屬于典型的組織蛋白酶中的半胱氨酸蛋白酶家族，第123～134位氨基酸殘基、第264～274位氨基酸殘基及第 281～300位氨基酸殘基分別為半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸、組氨酸及天冬氨酸活性位點。該蛋白存在組織蛋白酶 L所特有的保守基序 ERFNIN[E-X3-R-X2-(I/V)-F-X3-N-X3-I-X3-N]和 GCXGG。

2.3 EcCatL基因同源性分析

利用BLAST對脊尾白蝦EcCatL基因進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦 EcCatL基因與變色小長臂蝦(Palaemonetes varians)和北極甜蝦(Pandalus borealis)的同源性最高，分別為92%和76%。與其它蝦蟹類如挪威海螯蝦(Nephrops norvegicus)、美洲螯龍蝦(Homarus americanus)、刀額新對蝦(Metapenaeus ensis)、凡納濱對蝦、中華絨螯蟹及阿拉斯加帝王蟹(Paralithodes camtschaticus)等的同源性分別為 57%、56%、53%、53%、51%和 48%；與其它無脊椎動物動物如赤擬谷盜(Tribolium castaneum)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、長牡蠣(Crassostrea gigas)和紫海膽(Strongylocentrotus purpuratus)的同源性分別為 53%、52%、50%、51%和 50%；與脊椎動物非洲象(Loxodonta africana)的同源性為48%。利用MEGA 4.0軟件進行系統(tǒng)進化分析表明，脊尾白蝦組織蛋白酶 L EcCatL與變色小長臂蝦緊密聚為一支，之后聚類順序依次為北極甜蝦、挪威海螯蝦及美洲螯龍蝦等 (圖3)。

圖3 利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建的基于CatL氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進化樹Figure 3 NJ phylogenetic tree based on CatL amino acid sequences by MEGA 4.0

通過與北極甜蝦、凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦及中華絨螯蟹等甲殼動物的組織蛋白酶L的氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸、組氨酸及天冬氨酸活性位點都高度保守，保守基序ERFNIN、GNFD和GCXGG在8種甲殼動物中都存在。

2.4 EcCatL基因組織表達分析

利用Real-time PCR分析了脊尾白蝦EcCatL基因在不同組織中的表達水平，結(jié)果表明：EcCatL基因在血細胞、鰓、肝胰腺、肌肉、卵巢、腸、胃及眼柄中都有表達。其中，在肝胰腺中的表達量最高，其次為血細胞、鰓、胃、卵巢及肌肉，在腸和眼柄中的表達量最少(圖5)。

圖4 脊尾白蝦EcCatL氨基酸序列與其他物種CatL氨基酸序列比對Figure 4 Amino acid sequences alignment of E. carinicauda EcCatL with other species’ CatL

圖5 脊尾白蝦組織蛋白酶L EcCatL基因在不同組織中的表達分布Figure 5 Distribution of EcCatL gene expression in different tissues of E. carinicauda

Real-time PCR檢測脊尾白蝦在注射鰻弧菌和WSSV后不同時間血細胞中EcCatL基因的表達情況(圖6)。結(jié)果表明：鰻弧菌和WSSV刺激后，血細胞中 EcCatL基因的表達量都極顯著高于對照組(P＜0.01)。其中，鰻弧菌感染組和WSSV感染組血細胞中EcCatL基因表達量在注射早期(0～3 h)均出現(xiàn)下降，6～12 h開始不斷上升，于12 h達到最高值；在24～48 h表達量開始下降，并于48 h極顯著低于對照組(P＜0.01)；72 h后表達量逐漸上升至初始水平。血細胞中 EcCatL基因的表達量總體表現(xiàn)為下降、升高、再下降、再升高至初始水平的趨勢。

圖6 注射鰻弧菌和WSSV后脊尾白蝦血細胞中EcCatL基因的表達情況Figure 6 Expression of EcCatL gene in E. carinicauda hemocytes after V. anguillarum and WSSV injection

脊尾白蝦在注射感染鰻弧菌和WSSV后，肝胰腺中EcCatL基因的表達情況見圖7。結(jié)果表明：與對照組相比，鰻弧菌和 WSSV刺激后，肝胰腺中EcCatL的表達量都極顯著高于對照組(P＜0.01)。其中，鰻弧菌感染組和WSSV感染組血細胞中EcCatL基因的表達量在注射早期(0～3 h)均出現(xiàn)下降，6～12 h開始不斷上升，于12 h達到最高值，隨后逐漸下降；在24～48 h表達量開始上升，并于48 h表達量極顯著的高于對照組(P＜0.01)；72 h后血細胞中 EcCatL基因的表達量逐漸回落至初始水平。肝胰腺中 EcCatL基因的表達量總體表現(xiàn)為下降、升高、再下降、再升高、最后下降至初始水平的趨勢。

圖7 注射鰻弧菌和WSSV后脊尾白蝦肝胰腺中EcCatL基因的表達情況Figure 7 Expression of EcCatL gene in E. carinicauda hepatopancreas after V. anguillarum and WSSV injection

3 討論

本研究首次克隆得到脊尾白蝦組織蛋白酶 L EcCatL基因序列，全長1 136 bp，包含960 bp的開放閱讀框，編碼一個319個氨基酸組成的多肽。序列分析發(fā)現(xiàn)，與其他甲殼動物的組織蛋白酶L一樣，EcCatL基因編碼的氨基酸序列含有半胱氨酸、組氨酸和天冬氨酸3個半胱氨酸蛋白酶活性位點以及半胱氨酸蛋白酶中高度保守的GNFD基序、重要結(jié)構(gòu)基序GCXGG基序和組織蛋白酶L家族高度保守的ERFNIN [E-X3-R-X2-(I/V)-F-X3-N-X3-I-X3-N]基序。與其它動物氨基酸序列的比對發(fā)現(xiàn)該序列與已知甲殼動物的同源性較高，均＞80%。系統(tǒng)進化分析表明脊尾白蝦與變色小長臂蝦首先聚為一支，且與北極甜蝦、斑節(jié)對蝦和中華絨螯蟹等蝦蟹類的同源性＞50%。以上結(jié)果表明該序列為脊尾白蝦組蛋白酶L EcCatL基因。

研究報道表明，斑馬魚(Danio rerio)中發(fā)現(xiàn) 3種類型的組織蛋白酶L，合浦珠母貝(Pinctada fucata)中存在2種類型的組織蛋白酶L(Bai et al，2011)。本研究只發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦組織蛋白酶L的一種基因，是否存在其他類型，有待進一步研究。ERFNIN基序是組織蛋白酶L家族的高度保守基序(Bai et al，2011)，其中4個氨基酸是最保守的，而苯丙氨酸F和異亮氨酸I在不同物種中有所變化，本研究脊尾白蝦組織蛋白酶L的ERFNIN基序的異亮氨酸I被纈氨酸V所取代，該特征與北極甜蝦一致 (圖4)；而中華絨螯蟹和阿拉斯加帝王蟹的苯丙氨酸F被酪氨酸Y所取代。GCXGG基序也是半胱氨酸蛋白酶非常重要的結(jié)構(gòu)基序(Bai et al，2011；Karrer et al，1993)，除中間的 X代表不同的氨基酸外，其它 4種氨基酸均保守，脊尾白蝦組織蛋白酶 L的GCXGG基序中X為天冬氨酸N，而南美白對蝦為甲硫氨酸M，中華絨螯蟹和阿拉斯加帝王蟹為甘氨酸G，刀額新對蝦為半胱氨酸C。本研究脊尾白蝦組織蛋白酶L重要基序的序列保守性和與其他物種相同的酶活性位點，表明脊尾白蝦組織蛋白酶L與其他物種組織蛋白酶L具有相似的蛋白功能。

脊尾白蝦EcCatL基因的表達具有組織特異性，Real time-PCR結(jié)果顯示，脊尾白蝦EcCatL基因在血細胞、鰓、肝胰腺、肌肉、卵巢、腸、胃及眼柄中均有表達(圖5)。其中，在肝胰腺中的表達量最高，與中華絨螯蟹CatL基因組織表達情況一致(Li et al，2010)，在腸和眼柄中的表達量最少，說明脊尾白蝦肝胰腺是參與組織蛋白酶 L儲存和釋放的主要器官。

免疫系統(tǒng)主要包括固有免疫和獲得性免疫兩大類(Salminen et al，2008)。無脊椎動物缺乏抗體介導的獲得性免疫，其機體免疫防御的發(fā)揮主要依靠其固有免疫系統(tǒng)，如血細胞的吞噬、包囊以及血淋巴中的一些酶和免疫因子的殺菌、抗菌作用，以此來識別和有效清除入侵的微生物和寄生蟲等異物，保持體內(nèi)外平衡(Roch，1999)。組織蛋白酶L作為一種溶酶體蛋白，近年來在無脊椎動物的先天免疫調(diào)控方面的研究取得了較大的進展。De Gregorio對黑腹果蠅的研究表明，組織蛋白酶L表達量在細菌刺激后顯著上調(diào)，認為組織蛋白酶L是一種參與機體免疫反應(yīng)的重要基因(Tisca & Mosca，2004)。在被WSSV感染后，組織蛋白酶L在凡納濱對蝦肝胰腺中的表達量顯著上調(diào)，表明其參與了病毒防御過程(Zhao et al，2007)；在被鰻弧菌感染后，中華絨螯蟹CatL在血細胞中的表達量發(fā)生顯著性變化(Li et al，2010)；在被溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染后，合浦珠母貝CatL1和CatL2的表達量出現(xiàn)急劇變化(Ma et al，2010a, b)。因此，組織蛋白酶L可能在細菌和病毒的防御過程中起著重要作用。

為了研究組織蛋白酶L在脊尾白蝦非特異性免疫防御中的作用，本研究設(shè)計了細菌(鰻弧菌)和病毒(WSSV)感染實驗，發(fā)現(xiàn)感染后的脊尾白蝦血細胞和肝胰腺EcCatL表達量均有明顯的時間差異性，變化趨勢基本一致。注射鰻弧菌和WSSV后血細胞和肝胰腺中EcCatL的表達量均在12 h時達到最大值，與對照組相差異性極顯著(P＜0.01)，表明EcCatL可能參與了免疫反應(yīng)的應(yīng)答。刺激后 12～24 h EcCatL表達量下降，可能意味著機體處于感染后的恢復期(Sun et al，2010)。類似的基因表達情況也見于鰻弧菌刺激后的中華絨螯蟹(Li et al，2010)。注射鰻弧菌和WSSV后，脊尾白蝦血細胞EcCatL表達水平明顯高于肝胰腺，可能由組織器官功能差異性所致(Li et al，2012b)。血細胞是蝦類非特異免疫防御的首要組織，在病原體入侵后擔當機體非特異免疫防御的重任，能夠比其他組織更迅速地上調(diào)EcCatL基因表達。

本研究成功克隆了脊尾白蝦 EcCatL基因全長cDNA序列，通過分析鰻弧菌和WSSV感染后脊尾白蝦血細胞和肝胰腺中 EcCatL基因表達特征，可以進一步認定 EcCatL基因參與了脊尾白蝦的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在清除病原體的防御反應(yīng)中起著重要作用，為深入研究脊尾白蝦 EcCatL基因在病原體刺激下發(fā)揮免疫功能的途徑和機理奠定了基礎(chǔ)。

Bai ZY, Wang GL, Li JL. 2011. Cloning and characterization of cathepsin L gene and evolution analysis in Hyriopsis cumingii. Biotechnol Bull, (6):104-111. [白志毅, 汪桂玲, 李家樂. 2011. 三角帆蚌組織蛋白酶L基因的克隆和序列特征與進化分析. 生物技術(shù)通報, (6): 104-111.]

Bu XJ, Zhang XW, Sun YD, Zhao XF, Wang JX. 2008. Recombinant expression and tissue distribution of cathepsin L from Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis. J Fish Sci Chn, 15(6): 910-916. [卜興江, 仉曉文, 孫允東, 趙小凡, 王金星. 2008. 中國明對蝦組織蛋白酶L的原核重組表達及其組織分布. 中國水產(chǎn)科學, 15(6): 910-916.]

Dohchin A, Suzuki JI, Seki H, Masutani M, Shiroto H, Kawakami Y. 2000.Immunostained cathepsins B and L correlate with depth of invasion and different metastatic pathways in early stage gastric carcinoma. Cancer, 89(3):482-487.

Furuyama N, Fujisawa Y. 2000. Distinct roles of cathepsin K and cathepsin L in osteoclastic bone resorption. Endocr Res, 26(2): 189-204.

Han JY, Li J, Li JT, Chang ZQ, Chen P, Li H. 2011. Cloning and expression of heat shock protein 70 (HSP70) of Exopalaemon carinicauda. J Fisher Chn, 35(8): 1130-1138. [韓俊英, 李健, 李吉濤, 常志強, 陳萍, 李華.2011. 脊尾白蝦熱休克蛋白HSP70基因的克隆及其表達分析. 水產(chǎn)學報,35(8): 1130-1138.]

Karrer KM, Peiffer SL, Ditomas ME. 1993. Two distinct gene subfamilies within the family of cysteine protease genes. Proc Natl Acad Sci USA, 90(7):3063-3067.

Kos J, Werle B, Lah T, Brunner N. 2000. Cysteine proteinases and their inhibitors in extracellular fluids: markers for diagnosis and prognosis in cancer. Internat J Biolog Markers, 15(1): 84-89.

Li JT, Han JY, Chen P, Chang ZQ, He YY, Liu P, Wang QY, Li J. 2012a.Cloning of a heat shock protein 90 (HSP90) gene and expression analysis in the ridgetail white prawn Exopalaemon carinicauda. Fish Shellfish Immunol,32(6): 1191-1197.

Li MY, Li J, Liu P, Li JT. 2012b. Cloning and expression analysis of ferritin gene in Exopalaemon carinicauda. Oceanol Et Limnol Sin, 43(2): 306-312.[李美玉, 李健, 劉萍, 李吉濤. 2012. 脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda) ferritin基因克隆及表達分析. 海洋與湖沼, 43(2): 306-312.]Li WW, Jin XK, He L, Jiang H, Gong YN, Xie YN, Wang Q. 2010.Molecular cloning, characterization, expression and activity analysis of cathepsin L in Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis. Fish Shellfish Immunol, 29(6): 1010-1018.

Lindeman JH, Hanemaaijer R, Mulder A, Dijkstra PDS, Szuhai K, Bromme D, Verheijen JH, Hogendoorn PCW. 2004. Cathepsin K is the principal protease in giant cell tumor of bone. Amer J Pathol, 165(2): 593-600.

Liu LQ, Warner AH. 2006. Further characterization of the cathepsin L-associated protein and its gene in two species of the brine shrimp, Artemia.Comp Biochem Physiol A, 145(4): 458-467.

Liu RY. 1955. The Economic Shrimps in Northern of China. Beijing:Science Press. [劉瑞玉. 1955. 中國北部的經(jīng)濟蝦類. 北京: 科學出版社.]Ma JJ, Zhang DC, Cui SG, Jiang JJ, Pu HL, Jiang SG. 2010a. Molecular characterization and expression analysis of cathepsin L2 cysteine protease from pearl oyster Pinctada fucata. J Fish Sci Chn, 17(4): 701-712. [麻建軍,張殿昌, 崔淑歌, 姜晶晶, 蒲含林, 江世貴. 2010. 合浦珠母貝組織蛋白酶L2基因的特征與組織表達分析. 中國水產(chǎn)科學, 17(4): 701-712.]

Ma JJ, Zhang DC, Jiang JJ, Cui SG, Pu HL, Jiang SG. 2010b. Molecular characterization and expression analysis of cathepsin L1 cysteine protease from pearl oyster Pinctada fucata. Fish Shellfish Immunol, 29(3): 501-507.

Roch P. 1999. Defense mechanisms and disease prevention in farmed marine invertebrates. Aquaculture, 172(1-2): 125-145.

Salminen A, Huuskonen J, Ojala J, Kauppinen A, Kaarniranta K, Suuronen T. 2008. Activation of innate immunity system during aging: NF-kB signaling is the molecular culprit of inflamm-aging. Ageing Res Rev, 7(2):83-105.

Sun J, Wang BJ, Li XH, Sun SJ, Liu M, Jiang KY, Wang L. 2010. The full length cDNA cloning and expression profile of prophenoloxidase of Fenneropenaeus chinensis. J Fisher Chn, 34(1): 56-66. [孫杰, 王寶杰, 李曉華, 孫淑娟, 劉梅, 蔣克勇, 王雷. 2010. 中國明對蝦酚氧化酶原基因cDNA的克隆與表達特征. 水產(chǎn)學報, 34(1): 56-66.]

Tisca PG, Mosca F. 2004. Defense mechanisms in farmed marine molluscs.Vet Res Commun, 28(1): 57-62.

Venier P, De Pittà C, Pallavicini A, Marsano F, Varotto L, Romualdi C,Dondero F, Viarengo A, Lanfranchi G. 2006. Development of mussel mRNA profiling: can gene expression trends reveal coastal water pollution. Mutat Res, 602(1-2): 121-134.

Xu WJ, Xie JJ, Shi H, Li CW. 2010. Hematodinium infections in cultured ridgetail white prawns, Exopalaemon carinicauda, in eastern China.Aquaculture, 300(1-4): 25-31.

Xu WJ, Xie JJ, Shi H, Zhang J, Zhang JS. 2010. Infection of Hematodinium sp. in farmed ridgetail white prawn Exopalaemon carinicauda. Oceanol Et Limnol Sin, 41(3): 396-402. [許文軍, 謝建軍, 施慧, 張靜, 張家松. 2010.池塘養(yǎng)殖脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)感染血卵渦鞭蟲的研究.海洋與湖沼, 41(3): 396-402.]

Zeng GZ, Tan NH, Jia RR, Pan XL. 2005. Cathepsins: Structures, Functions and Inhibitors. Acta Bot Yunnanica, 27(4): 337-354. [曾廣智, 譚寧華, 賈銳銳, 潘蓄林. 2005. 組織蛋白酶及其抑制劑研究進展. 云南植物研究,27(4): 337-354.]

Zhao ZY, Yin ZX, Wang SP, Guan HJ, Li SD, Xing K, Chan SM, He JG.2007. Profiling of differentially expressed genes in hepatopancreas of white spot syndrome virus-resistant shrimp (Litopenaeus vannamei) by suppression subtractive hybridisation. Fish Shellfish Immunol, 22(5): 520-534.