護(hù)舍安對(duì)大腸桿菌的體外抑制作用研究

劉林艷 文利新 蔣政云 許道軍＊

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南省長(zhǎng)沙市 410128；2長(zhǎng)沙綠葉生物科技有限公司，湖南省長(zhǎng)沙市 410125）

良好的畜舍環(huán)境對(duì)于疫病防控、提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能及飼料報(bào)酬等方面均具有重要作用[1,2]。動(dòng)物體內(nèi)外及畜舍環(huán)境均存在著種類繁多，數(shù)量巨大的微生物群落，正常狀態(tài)下，這些微生物群落可維持穩(wěn)定的微生態(tài)平衡，與宿主動(dòng)物處于良好的共生狀態(tài)，這對(duì)宿主動(dòng)物保持健康具有重要意義[3]。但在畜牧生產(chǎn)中，動(dòng)物的不斷進(jìn)出、頻繁的消毒及抗菌藥物的使用，均對(duì)微生態(tài)平衡產(chǎn)生了不利影響。為了防止有害菌群的過(guò)度繁殖，大劑量的抗生素等藥物被普遍使用，導(dǎo)致了藥物殘留和耐藥菌株的產(chǎn)生，已嚴(yán)重危害到人類健康。微生態(tài)制劑是近年發(fā)展起來(lái)的新型綠色添加劑，具有無(wú)殘留、無(wú)毒副作用等特點(diǎn)。在養(yǎng)殖過(guò)程中定期、適量的補(bǔ)充有益微生物，利用有益菌群來(lái)抑制或殺死有害菌，可顯著改善養(yǎng)殖微生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和飼料利用率的提高，達(dá)到生態(tài)防治的目的[3]。

護(hù)舍安是湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物保健工程技術(shù)中心開(kāi)發(fā)的一種畜舍微生態(tài)改良劑，主要由多種有益微生物組合及礦物吸附劑組成。將該產(chǎn)品噴撒于畜舍環(huán)境中，通過(guò)有益微生物的增殖來(lái)快速分解畜舍內(nèi)部殘留的飼料和動(dòng)物排泄物，且益生菌分泌的多種抗菌物質(zhì)能抑制有害微生物的繁殖；通過(guò)礦物吸附劑來(lái)快速吸附環(huán)境中的有害代謝物、水分和有害氣體等，以此快速建立良好的畜舍環(huán)境。該產(chǎn)品在大量的臨床使用過(guò)程中，能夠顯著的降低仔豬黃、白痢和母豬產(chǎn)后感染的發(fā)生，并可有效降低抗生素的使用量。為了進(jìn)一步分析護(hù)舍安對(duì)畜舍病原微生物的影響，本研究以豬場(chǎng)常見(jiàn)的大腸桿菌為研究對(duì)象，初步研究了護(hù)舍安對(duì)大腸桿菌的體外抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

護(hù)舍安由長(zhǎng)沙綠葉生物科技有限公司提供 （圖1）。大腸桿菌由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院從仔豬白痢病料中分離培養(yǎng)所得。

圖1 護(hù)舍安

1.2 方法

1.2.1 LB液體培養(yǎng)基配制

在950 mL去離子水中加入胰化蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉5 g，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解，用5 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0，去離子水定容至1 L，0.1 MPa，120℃滅菌20分鐘。

1.2.2 LB固體培養(yǎng)基配制

在LB液體培養(yǎng)基中按15 g/L的比例加入瓊脂粉，溶解均勻，0.1 MPa，120℃滅菌20分鐘。用吸管準(zhǔn)確量取20 mL培養(yǎng)基，加入已滅菌并干燥的玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，室溫下凝固并靜置4～8小時(shí)。

1.2.3 護(hù)舍安培養(yǎng)液制備

準(zhǔn)確稱取護(hù)舍安1 g，加入無(wú)菌生理鹽水100 mL，置于37℃水浴搖床，200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)30分鐘后取0.1 mL置于200 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200轉(zhuǎn)/分鐘搖瓶培養(yǎng)24小時(shí)后備用。

1.2.4 大腸桿菌培養(yǎng)平板的制備

用接種環(huán)取單個(gè)大腸桿菌菌落接種于200 mL LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃，200轉(zhuǎn)/分鐘搖瓶培養(yǎng)12小時(shí)。再取培養(yǎng)好的大腸桿菌培養(yǎng)液0.1 mL，加入生理鹽水9.9 mL,混合均勻，取0.2 mL稀釋好的大腸桿菌菌液置于LB固體培養(yǎng)平板。用涂布器均勻涂布后備用。

1.2.5 護(hù)舍安對(duì)大腸桿菌的體外抑制試驗(yàn)

參照劉冬梅[4]等建立的方法，在已涂布大腸桿菌的培養(yǎng)平板中小心放入牛津杯，輕壓，加入培養(yǎng)24小時(shí)的護(hù)舍安培養(yǎng)液0.2 mL，蓋上培養(yǎng)皿，置于37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12小時(shí)觀察后抑菌判斷效果：抑菌圈直徑≥15 mm，為強(qiáng)抑菌作用；10～15 mm為抑菌作用；5～10 mm為弱抑菌或不完全抑菌作用；無(wú)抑菌圈的為不抑菌[5]。

2 結(jié)果與分析

從圖2的結(jié)果可知，護(hù)舍安培養(yǎng)液對(duì)于大腸桿菌的抑菌圈邊緣清晰，抑菌圈直徑達(dá)25 mm，屬于強(qiáng)抑菌作用。這一結(jié)果表明，護(hù)舍安中含有的益生菌群在培養(yǎng)過(guò)程中，能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制或殺死大腸桿菌的物質(zhì)。

3 討論

近年來(lái)，微生態(tài)制劑作為一種綠色飼料添加劑用于維護(hù)動(dòng)物胃腸道的微生態(tài)平衡和動(dòng)物健康方面的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展[6]，但利用微生態(tài)制劑維護(hù)動(dòng)物生活環(huán)境的微生態(tài)平衡尚處于起步階段。動(dòng)物在生活過(guò)程中不斷與環(huán)境發(fā)生相互作用，良好的畜舍環(huán)境與動(dòng)物健康息息相關(guān)。畜舍環(huán)境中有機(jī)物含量豐富，主要包括動(dòng)物的排泄物、皮屑、飼料殘留等，這些有機(jī)物是微生物的天然培養(yǎng)基，條件適宜時(shí)，微生物能夠在短時(shí)間內(nèi)大量增殖，單純使用抗生素或消毒藥難以有效抑制有害微生物的繁殖。目前臨床上使用的益生菌如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等能夠在畜舍內(nèi)部快速的繁殖，營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)性抑制有害菌的增殖，同時(shí)，利用益生菌自身分泌的抗菌素、短桿菌肽、枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素等物質(zhì)來(lái)抑制或殺滅有害微生物[7]，從而使畜舍環(huán)境維持在一個(gè)以益生菌占主體的微生態(tài)平衡狀態(tài)，減少有害微生物對(duì)動(dòng)物機(jī)體的危害。

本試驗(yàn)的結(jié)果也清晰表明，微生態(tài)制劑的培養(yǎng)液對(duì)于大腸桿菌的繁殖發(fā)揮了強(qiáng)烈的抑制或殺滅作用，這也很好的解釋了護(hù)舍安為何在產(chǎn)房使用過(guò)程中顯著降低仔豬黃、白痢及母豬產(chǎn)道感染的原因。護(hù)舍安特有的干燥、吸附和補(bǔ)充有益菌功效能夠有效保持畜舍良好的微生態(tài)環(huán)境，抑制有害菌群的繁殖，減少抗生素的使用量。該產(chǎn)品通過(guò)對(duì)畜舍微生態(tài)平衡的控制來(lái)達(dá)到防控疫病微生物的目的，目前，在我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)濫用藥物、耐藥菌株普遍存在、藥物殘留的背景下，該產(chǎn)品在動(dòng)物健康養(yǎng)殖領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1]王美芝，吳中紅，劉繼軍，等．標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)?；i場(chǎng)中豬舍的環(huán)境控制.豬業(yè)科學(xué)，2011，（3）：28-31.

[2]許道軍，文利新，蔣政云.豬病防控應(yīng)重視環(huán)境控制.中國(guó)豬業(yè)，2011，（7）：32-33.

[3]劉力.運(yùn)用微生態(tài)平衡拯救畜禽規(guī)?；B(yǎng)殖.中國(guó)動(dòng)物保健，2007，（9）：19-21.

[4]劉冬梅，李理，楊曉泉，等.用牛津杯法測(cè)定益生菌的抑菌活力.食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27(3)：110-111.

[5]Clinical and Laboratory Standards Institute.CLSIDocumentM100 －S18，Performance standards for antimicrobial susceptibility testing.Eighteenth informational supplement.

[6]竇茂鑫，吳濤.飼用微生態(tài)制劑的發(fā)展現(xiàn)狀與應(yīng)用性研究.飼料研究，2013，（1）：15-17.

[7]高衛(wèi)華.芽孢桿菌胞外蛋白酶合成及抑菌功能的調(diào)控機(jī)制研究.天津：南開(kāi)大學(xué)，2010：15-19.