腓骨肌萎縮癥(CMT)1型的臨床、神經(jīng)電生理及CMT1A型基因診斷方法的研究

史 磊， 曹秉振

腓骨肌萎縮癥(charcot-marie-tooth disease，CMT)又稱遺傳性運(yùn)動(dòng)感覺神經(jīng)病(hereditary motor and sensory neuropathy，HMSN)，是最常見的遺傳性周圍神經(jīng)疾病，發(fā)病率為1/2500［1］。其主要特征為慢性進(jìn)行性加重的肢體遠(yuǎn)端無力、肌萎縮和感覺損害。CMT的遺傳方式主要為常染色體顯性遺傳(AD)，也可見常染色體隱性遺傳(AR)及X連鎖顯性或隱性遺傳(XD或 XR)。根據(jù)電生理和病理特征，CMT可分為CMT1(脫髓鞘型)、CMT2(軸索型)和其他較罕見的類型［2］。目前，分子生物學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了近40個(gè)不同的CMT致病基因位點(diǎn)，20多個(gè)致病基因已被克隆。臨床上最常見的類型為CMT1型，其中50% ～70%的CMT 1患者及90%的散發(fā)病例為 CMT1A型［3］，多由17號(hào)染色體短臂11.2區(qū)(17p11.2)包含周圍髓鞘蛋白 PMP 22基因在內(nèi)的1.5MB的正向串聯(lián)重復(fù)突變所致。

我們收集了5例臨床基本確診為CMT1型的患者，分析比較他們的臨床和電生理特點(diǎn)，并分別應(yīng)用等位基因特異性PCR和多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)兩種方法對(duì)5例患者進(jìn)行PMP22基因重復(fù)突變檢測(cè)，初步驗(yàn)證兩種方法所得結(jié)果的一致性，指導(dǎo)臨床開展相關(guān)基因篩查和診斷的基本程序以進(jìn)一步確定CMT1A型的診斷。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 5例CMT1型患者均來源于濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及住院的病例。所有患者均由神經(jīng)內(nèi)科專科醫(yī)生進(jìn)行詳細(xì)的病史詢問和體格檢查，符合Harding于1980年制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。所有受試者均征得本人知情同意。

1.2 神經(jīng)電生理檢查 主要為運(yùn)動(dòng)和感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度的檢查，上肢包括正中神經(jīng)和尺神經(jīng)，下肢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)主要檢查腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)，感覺神經(jīng)為腓淺神經(jīng)和腓腸神經(jīng)。

1.3 基因突變檢測(cè)

1.3.1 等位基因特異性PCR檢測(cè) 抽取患者外周靜脈血3～5ml，用EDTA抗凝，Promega試劑盒提取全血標(biāo)本基因組DNA。在PMP22基因重復(fù)片段的遠(yuǎn)端和近端的區(qū)域內(nèi)，設(shè)計(jì)出等位基因特異性引物，使其可擴(kuò)增出患者特異性重復(fù)連接片段［5］，PCR反應(yīng)體系為:總體積50μl，其中 dNTP Mixture(2mmol/L)5μl，10 × PCR buffer 5μl，TaqDNA 聚合酶0.25U，基因組 DNA2μl，上下游引物(5μmol/L)各5μl，三蒸水 27.75μl。反應(yīng)條件為在 GeneAmp PCR system 2400熱循環(huán)儀上94℃預(yù)變性5min，然后 94℃變性 30s，56℃退火 1min，72℃延伸 3min，25次循環(huán)，最后72℃延伸5min，4℃保存。反應(yīng)完成后取5μl PCR產(chǎn)物與1μl溴乙錠混合，0.8%瓊脂糖凝膠電泳(加核酸染色液)檢測(cè)產(chǎn)物。

1.3.2 MLPA檢測(cè) MLPA檢測(cè)試劑盒 SALSA P033 購(gòu)自 MRC-Holland，取基因組 DNA 1μl，加TE稀釋至5μl，在熱循環(huán)儀上98℃變性5min后冷卻至 25℃，分別加入 1.5μl P033探針混合物及1.5μl MLPA buffer，小心混勻后 95℃ 變性 1min，60℃下雜交16h～20h。雜交后在54℃下加入連接混合物(25μl三蒸水，3μl連接緩沖液 A，3μl連接緩沖液 B，1μl連接酶)孵育15min，然后98℃加熱5min以滅活連接酶，待溫度降至20℃后，加入PCR反應(yīng)混合物(7.5μl三蒸水，2μlSALSA PCR 引物混合物，0.5μl SALSA 聚合酶)，PCR 反應(yīng)條件為:95℃變性30s，60℃ 退火 30s，72℃ 延伸 60s，循環(huán) 35 次，72℃延伸 20min，取0.7μl PCR 反應(yīng)產(chǎn)物加入 0.2μl LIZ-500標(biāo)記物及9μl甲酰胺(LIZ-500及甲酰胺均為美國(guó)ABI公司生產(chǎn))，80℃變性2min后立即置冰架上冷卻，最后用毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)(在ABI3130基因測(cè)序儀上進(jìn)行)，程序結(jié)束后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，結(jié)果用Coffalyser軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 4例患者20歲前發(fā)病，其中2例有家族史，1例患者30歲左右發(fā)病，無家族史。所有患者均表現(xiàn)進(jìn)行性四肢遠(yuǎn)端無力伴肌萎縮，下肢重于上肢，4例患者四肢遠(yuǎn)端感覺減退，1例患者感覺減退不明顯。所有患者均出現(xiàn)腱反射減弱或消失，2例患者出現(xiàn)足弓變形。

2.2 神經(jīng)電生理檢查 2例患者上肢正中神經(jīng)傳導(dǎo)速度嚴(yán)重降低(＜25m/s)，3例患者上肢正中神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯降低(＜38m/s)，4例患者下肢腓總神經(jīng)傳導(dǎo)速度嚴(yán)重降低(＜20m/s)，1例患者明顯降低(＜38m/s)。4例患者所檢上下肢感覺神經(jīng)未引出動(dòng)作電位，1例患者所檢感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯降低?；颊咚鶛z神經(jīng)波幅均有不同程度降低。

2.3 基因突變分析

2.3.1 等位基因特異性PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果1例患者出現(xiàn)了經(jīng)特異引物擴(kuò)增的特異性短片段重復(fù)的異常條帶，其余4例患者未出現(xiàn)異常條帶。

2.3.2 MLPA檢測(cè)分析 運(yùn)行軟件Coffalyser分析得出:4例患者的PMP22基因全部在正常范圍內(nèi)，只有1例患者PMP22基因的幾乎所有外顯子均在正常范圍上限以上，表明這例患者存在PMP22基因的重復(fù)突變(圖1為PMP22基因重復(fù)突變患者的分析結(jié)果，正常范圍結(jié)果圖略)。

3 討論

CMT1型的患者發(fā)病年齡較早，常兒童期起病，患者表現(xiàn)比同齡兒童跑跳困難，而后出現(xiàn)進(jìn)行性四肢無力和肌萎縮，嚴(yán)重時(shí)可見爪型手和弓形足。此次收集的病例臨床癥狀相對(duì)單一，未見有其他報(bào)道中提到的神經(jīng)功能重度受損、，如伴錐體束征、伴神經(jīng)性耳聾等相關(guān)癥狀出現(xiàn)［6］，說明CMT1臨床表型的變異較大。

臨床上常根據(jù)電生理和病理特點(diǎn)大致分為CMT1型(脫髓鞘型)和CMT2型(軸索型)，電生理主要依據(jù)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)減慢的程度和波幅是否降低未區(qū)分，脫髓鞘型一般表現(xiàn)為正中神經(jīng)NCV＜38m/s且波幅無明顯降低，而軸索型出現(xiàn)波幅明顯降低但正中神經(jīng)NCV ＞38m/s。本研究中患者均出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢，其中2例較嚴(yán)重病例正中神經(jīng)NCV＜25m/s，下肢腓總神經(jīng)NCV＜20m/s，且出現(xiàn)繼發(fā)性波幅降低?；颊唠m表現(xiàn)四肢末端感覺障礙較輕但是感覺神經(jīng)的動(dòng)作電位較難引出。可見神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低往往會(huì)繼發(fā)波幅降低，同樣波幅降低也會(huì)繼發(fā)神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢，所以很多情況根據(jù)電生理不好明確區(qū)分。神經(jīng)病理活檢可以明確患者為何種類型，但損傷較大，患者接受程度較低。相比之下基因檢測(cè)的準(zhǔn)確性高，基本無損傷，在病程早期即可做出明確診斷，有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究中采用了兩種方法檢測(cè)患者的PMP22基因是否存在短片段重復(fù)突變，等位基因特異性PCR是直接對(duì)PMP22基因交換熱點(diǎn)區(qū)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出特異性連接片段，Kon-Ping Lin等根據(jù)已被共識(shí)的近端和遠(yuǎn)端CMT1A-REP序列設(shè)計(jì)出了PMP22等位基因特異性引物［7］，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行，對(duì)操作條件及成本要求較低，但其靈敏度和準(zhǔn)確性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。而新技術(shù)MLPA-CMT1A試劑盒的探針基本覆蓋了PMP22基因外顯子的所有熱點(diǎn)區(qū)域，且能同時(shí)檢測(cè)基因的重復(fù)與缺失，敏感度及準(zhǔn)確度較等位基因特異性PCR更高，且MLPA與熒光定量PCR、STR等方法相比也具有一定的優(yōu)勢(shì):(1)可同時(shí)檢測(cè)多基因多外顯子的重復(fù)或缺失。(2)對(duì)DNA模板定量及純度要求較低。當(dāng)然，MLPA也有自身的缺點(diǎn)和限制，比如價(jià)格稍昂貴、對(duì)實(shí)驗(yàn)室的配置條件要求較高等。因此，兩種方法對(duì)特異性短片段重復(fù)突變的檢測(cè)都具有不可替代的作用和意義。建議在臨床患者初篩或基礎(chǔ)設(shè)施比較簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室條件下，可以先采用等位基因特異性PCR進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)可疑陽(yáng)性患者再進(jìn)一步選擇靈敏度和準(zhǔn)確度更高的MLPA確定診斷。

CMT涉及的致病基因較多，僅CMT1型相關(guān)的基因就有6個(gè)，基因檢測(cè)雖然準(zhǔn)確性高但要確定具體的致病基因可能需要多次實(shí)驗(yàn)，未檢測(cè)出PMP22基因重復(fù)突變的患者很有可能存在其他基因的突變，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)綜合研究了CMT1型患者的臨床和電生理特征，同時(shí)研究了CMT1A型基因突變的檢測(cè)方法，旨在指導(dǎo)臨床根據(jù)電生理特征及PMP22基因重復(fù)突變的檢測(cè)更好地確定CMT1A型的診斷。

圖1 PMP22基因重復(fù)突變患者的分析結(jié)果

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