食藥兼用真菌姬松茸胞外多糖的結(jié)構(gòu)分析及其生物活性

張 卉

(沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110142)

0 引 言

自從20世紀70年代真菌多糖抑制腫瘤的活性被發(fā)現(xiàn)以來，真菌多糖一直是生物化學(xué)、免疫學(xué)、醫(yī)藥學(xué)和食品科學(xué)等學(xué)科的一個熱點研究領(lǐng)域[1－2]。但由于真菌多糖是極其復(fù)雜的多聚體，來自不同真菌的多糖即使具有相同的單糖組成，其理化性質(zhì)、生物活性也可能差別很大。目前已發(fā)現(xiàn)真菌多糖的生物活性與其精細結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象有關(guān)，但在多糖構(gòu)效關(guān)系等方面仍有許多問題有待闡明[3]。

姬松茸(AgaricusblazeiMurr.)是一種珍貴的食藥兼用真菌。20世紀80年代開始，因發(fā)現(xiàn)姬松茸子實體多糖具有免疫力調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗氧化等功效而受到廣泛關(guān)注[4－5]。由于栽培條件要求高等因素，姬松茸子實體供應(yīng)量遠遠不能滿足市場需求。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)采用液態(tài)深層發(fā)酵替代固態(tài)栽培產(chǎn)生的姬松茸菌絲體和發(fā)酵液中也含有豐富的活性多糖成分[6－8]，而且該法可實現(xiàn)姬松茸菌絲體和發(fā)酵液的工廠化周年生產(chǎn)，為真菌生物活性多糖的來源開辟了新途徑。

本項目對姬松茸液態(tài)深層發(fā)酵液中的胞外多糖的結(jié)構(gòu)及其動物體內(nèi)對免疫器官的影響和抗腫瘤活性進行了研究，以探索多糖的構(gòu)效關(guān)系，為更好地開發(fā)和利用姬松茸多糖奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

真菌多糖AbEXP1a：由真菌姬松茸發(fā)酵液經(jīng)冷乙醇沉淀，Sevag法脫蛋白8～12次，H2O2脫色、透析、DEAE－纖維素柱層析和Sephadex G－200凝膠過濾獲得[9]。

S－180實體腫瘤：由中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。

實驗動物：昆明種小鼠，體重18～20g，40只，雌雄各半，購于中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀，Waters 510型；傅里葉變換紅外光譜儀，NIGOLT 550型；核磁共振儀，Bruker AVANCE 500。

1.3 多糖結(jié)構(gòu)分析方法

1.3.1 單糖組分分析

稱取純化多糖20.0mg，溶解于4mL濃度為2mol／L 硫酸中，封管，105 ℃ 水 解8h[10－11]。切開封管，水解液BaCO3中和，在4℃、10 000g條件下離心5min，所得上清液經(jīng)真空濃縮，采用HPLC法分析其單糖組分。HPLC色譜條件：Sugar Pak－1柱(30cm×5.9cm)，柱溫70℃，流動相為1mmol／L EDTA 二鈉鈣，體積流量0.4mL／min，示差折光檢測器檢測[12]。

1.3.2 紅外光譜分析

KBr壓片法：取干燥樣品2mg左右，KBr壓片，400～4 000cm－1掃描[13]。

1.3.3 核磁共振分析

將多糖AbEXP1a溶解于D2O，進行13C和1H核磁共振分析.

1.4 多糖抗腫瘤活性檢測

小鼠常規(guī)接種S－180實體瘤，次日隨機分組，每組10只。給藥組分別按照5、10和20mg／(kg·d)劑量進行腹腔注射多糖，每日1次，連續(xù)給藥10d。對照組給予等量的生理鹽水。末次給藥后的次日，眼眶放血處死小鼠，稱體重，再剝?nèi)∑⑴K、胸腺稱重，計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，比較與對照組的差異顯著性；剖取瘤塊稱重并計算抑瘤率[14－15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖AbEXP1a的結(jié)構(gòu)

2.1.1 AbEXP1a的單糖組成

圖1中2個峰的保留時間分別為11.936和13.422min，與相同色譜條件下葡萄糖標準品的保留時間(11.938min)和甘露糖標準品的保留時間(13.534min)基本相同，表明AbEXP1a含有葡萄糖和甘露糖2種單糖組分。兩峰的峰面積比約為3∶1，表明多糖AbEXP1a分子中葡萄糖和甘露糖的比例為3∶1。

2.1.2 AbEXP1a的紅外光譜分析結(jié)果

多糖AbEXP1a的紅外光譜見圖2。根據(jù)《Sadtler Reference Spectra Collection》中多糖的標準譜圖及有關(guān)資料對圖2進行分析，結(jié)果如下：在3 406.75cm－1處有O—H鍵的伸縮振動的強寬吸收峰，表明多糖AbEXP1a分子中有大量氫鍵；在2 929.50cm－1處有糖環(huán)上C—H鍵的伸縮振動產(chǎn)生的吸收峰，表明分子中有C—H結(jié)構(gòu)；在1 647.38和1 422.66cm－1處是多糖類物質(zhì)的特征吸收峰；在1 149～1 017cm－1是糖環(huán)上C—O鍵的吸收峰；在810cm－1處是甘露糖的特征吸收峰；在749.99cm－1處是吡喃環(huán)的特征吸收峰；在416.56cm－1處的是吡喃環(huán)碳骨架強吸收峰。在930～950cm－1無吸收峰，而在890和850cm－1處有吸收峰，表明分子中存在α型和β型糖苷鍵，且根據(jù)吸收峰的強弱可知該多糖分子中以β型糖苷鍵為主[16－18]。

圖2 多糖AbEXP1a的紅外光譜圖Fig.2 IR spectrum of AbEXP1a

2.1.3 AbEXP1a的核磁共振分析結(jié)果

圖3為AbEXP1a的1H－NMR譜圖，由圖3可見，共振信號的主要化學(xué)位移小于5.0，表明該多糖分子中以β型糖苷鍵為主。而化學(xué)位移大于5.0處也有吸收峰，表明其分子中也含有α型糖苷鍵?；瘜W(xué)位移在4.95和5.2～5.4處有吸收峰，表明該多糖分子中有葡萄糖和甘露糖。

圖3 AbEXP1a的1 H－NMR譜圖Fig.3 1 H－NMR spectrum of AbEXP1a

圖4為AbEXP1a的13C－NMR譜圖，由圖4可見，δ為100.3、101.9處有吸收峰，表明分子中含有葡萄糖和甘露糖；δ為86.52附近無吸收峰，表明無C3取代；δ在70～78范圍內(nèi)有吸收峰，表明無C4取代；δ在60.6、60.0附近有吸收峰，且δ在68.8處有吸收峰，表明其分子中有部分C6被取代。此外，在82～84及103～112均無信號，表明糖環(huán)非呋喃糖型，而是吡喃型[19]。

圖4 AbEXP1a的13C－NMR譜圖Fig.4 13 C－NMR spectrum of AbEXP1a

綜合以上結(jié)果，推測多糖AbEXP1a分子由葡萄糖和甘露糖構(gòu)成，二者的比例為3∶1，其主鏈由3個吡喃葡萄糖分子通過β－(1→6)糖苷鍵連接，再以α－(1→6)或β－(1→6)與吡喃甘露糖連接。

2.2 多糖AbEXP1a抗腫瘤活性檢測結(jié)果

多糖AbEXP1a對小鼠免疫器官指數(shù)的影響及對小鼠移植腫瘤的作用見表1。由表1可見，各受試組小鼠的體重與對照組相比無顯著性差異。3種劑量的胞外多糖均對小鼠的脾指數(shù)有顯著影響，但只有較高濃度組對于胸腺指數(shù)才有顯著影響。與對照相比，三劑量組對小鼠S－180移植腫瘤的抑制率均有顯著性差異，但中高劑量組之間的腫瘤抑制率沒有顯著差別。10mg／mL劑量對S－180移植腫瘤的抑制率可達64.04%。

表1 多糖AbEXP1a對小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)和移植腫瘤的抑制作用(ip)Tab.1 Influence of polysaccharide AbEXP1aon spleen index，thymus index and transplantation tumor inhibition effect in mice(ip)

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

姬松茸胞外多糖AbEXP1a由葡萄糖和甘露糖構(gòu)成，二者的比例為3∶1。AbEXP1a分子的主鏈由3個連續(xù)的吡喃型葡萄糖分子通過β－(1→6)糖苷鍵連接，再通過α－(1→6)或β－(1→6)糖苷鍵與吡喃型甘露糖連接而成。

多糖AbEXP1a具有提高小鼠免疫器官質(zhì)量指數(shù)，即提高小鼠機體免疫作用，還具有抗腫瘤作用。

3.2 討 論

關(guān)于真菌多糖的結(jié)構(gòu)與功效之間的關(guān)系一直是糖生物學(xué)研究的主要方向之一，比較一致的觀點認為多糖鏈連接鍵的類型、多糖的相對分子質(zhì)量和立體結(jié)構(gòu)對生物活性有重要影響，但是至今尚未有突破。

多糖主鏈的構(gòu)型是決定其功效的關(guān)鍵因素之一。一般認為以β－(1→3)糖苷鍵或β－(1→6)糖苷鍵構(gòu)成主鏈的真菌多糖大多具有抗腫瘤、免疫增強等生物活性[20]。對β－(1→3)葡聚糖的研究表明，此種構(gòu)型有利于形成螺旋狀結(jié)構(gòu)，具有較高的生物活性和抗腫瘤活性。對香菇多糖、云芝多糖、灰樹花多糖、金針菇多糖和蟲草多糖等[21－23]的結(jié)構(gòu)分析都符合這一規(guī)律。本文研究的姬松茸多糖具有β－(1→6)糖苷鍵，為其抗腫瘤等生物活性提供了結(jié)構(gòu)上的依據(jù)。

[1]杜巍，李元瑞，袁靜.食藥用菌多糖生物活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系[J].食用菌，2001(2)：3－5.

[2]高小榮，劉培勛.多糖構(gòu)效關(guān)系研究進展[J].中草藥，2004，35(2)：229－231.

[3]王文平，郭祀遠，李琳.生物活性多糖的結(jié)構(gòu)及構(gòu)效關(guān)系研究進展[J].中華實用中西醫(yī)雜志，2006(19)：2363－2367.

[4]KAWAGISHI H，INAGAKI R.Fractionation and antitumor activity of the water－insoluble residue ofAgaricusblazeifruiting bodies[J].Carbohydrate Research，1989，186(2)：267－273.

[5]KAWAGISHI H，KANAO T.Formolysis of a potent antitumor complex fromAgaricusblazeifruiting bodies and antitumor activity of the resulting products[J].Carbohydrate Polymers，1990，12(4)：393－403.

[6]張卉.姬松茸發(fā)酵液多糖的分離純化及理化性質(zhì)分析[J].沈陽化工學(xué)院學(xué)報，2005，19(4)：245－248.

[7]賈薇，劉艷芳，張勁，等.姬松茸菌絲體多糖提取方法初探食用菌學(xué)報[J].食用菌學(xué)報，2003，10(3)：41－44.

[8]張龍濤，王舒寧，龔暉，等.姬松茸液體發(fā)酵各組分多糖對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，36(1)：72－76.

[9]張勁松，韓瑋瑋，潘迎捷.云芝子實體多糖(CVP)化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究[J].菌物系統(tǒng)，2001，20(4)：531－535.

[10]GUTIéRREZ A，PRIETO A，MARTíNEZ A T.Structural characterization of extracellular polysac－charides produced by fungi from the genusPleurotus[J].Carbohydrate Research，1996，281(1)：143－154.

[11]CHEN Jinghua，ZHOU Jinpin，ZHANG Lina，et al.Chemical structure of the water－insoluble polysaccharide isolated from the fruiting body ofGanodermalucidum[J].Polymer Journal，1998，30(10)：838－842.

[12]張卉.真菌多糖AbEXP1－a的結(jié)構(gòu)及其免疫調(diào)節(jié)活性研究[J].科技導(dǎo)報，2005，23(11)：50－53.

[13]SOUMITRA M，INDRANIL C，DILIP R.Isolation and structural elucidation of water－soluble polysaccharide of a wild edible mushroom，Termitomyces striatus[J].Carbohydrate Research，2006，341(7)：878－886.

[14]夏丙南，孫瑞元，張家銓，等.藥理學(xué)實驗教程[M].貴陽：貴州人民出版社，1983：163－169.

[15]張卉，孫麗霞，陶明明.姬松茸胞外多糖AbEXP1－a免疫調(diào)節(jié)活性研究[J].沈陽化工學(xué)院學(xué)報，2007，21(2)：102－104.

[16]夏朝紅，戴奇，房韋，等.幾種多糖的紅外光譜研究[J].武漢理工大學(xué)學(xué)報，2007，29(1)：45－47.

[17]趙明，常鈺，王佩香，等.桑葉多糖PMP12的分離純化及結(jié)構(gòu)初步分析[J].江蘇大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2010，20(2)：154－156.

[18]孫希云，劉寧，孟憲軍，等.藍莓多糖BBP3－1的分離及結(jié)構(gòu)分析[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2011，23(6)：1080－1084.

[19]杜秀菊，張勁松，潘迎捷.核磁共振技術(shù)在食用菌多糖結(jié)構(gòu)分析中的作用[J].中國食用菌，2010，29(1)：3－6.

[20]VIJAYABASKAR P，BABINASTARLIN S，SHANKAR T，et al.Quantification and characterization of exopolysaccharides fromBacillussubtilis(MTCC 121)[J].Advances in Biological Research，2011，5(2)：71－76.

[21]BADALYAN S，HAMBARDZUMYAN L A.Investigation of immunomodulating activity of the medicinal mushroomFlammulinavelutipes(Curt.Fr.)P Karst.in vitro.cytokine induction by fruiting body extract[J].International Journal of Medicinal Mushrooms，2001，3(2／3)：110.

[22]BISKO N A，GULICH M A，OLISHEVSKAYA O D，et al.Immunological studies of the edible and medicinal mushroomLentinusedodes(Berk.)Sing[J].International Journal of Medicinal Mushrooms，2001，3(2／3)：121.

[23]于廣利，王瑩，趙峽，等.一種堿溶性灰樹花菌絲體多糖GFM2A的制備和結(jié)構(gòu)表征[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2007，28(1)：87－91.