利用糖廠濾泥生產(chǎn)根瘤菌菌劑

劉 曉 舉，陳 寶 娣，郭 繼 強(qiáng)

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

濾泥是甘蔗糖廠主要的廢棄物，其中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[1]，如糖分、蛋白質(zhì)等，直接丟棄不僅污染環(huán)境而且浪費(fèi)資源[2]。目前糖廠濾泥一般用于生產(chǎn)開發(fā)濾泥飼料、有機(jī)肥[3]。根瘤菌肥料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中扮演重要的角色，根瘤菌菌劑是含有根瘤菌的產(chǎn)品，在播種過程中可以接種在種子或者土壤中使用[4]。根瘤菌經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)之后轉(zhuǎn)入固體粉末載體中，經(jīng)過一段時(shí)間的增值和適應(yīng)之后就形成了根瘤菌菌劑。實(shí)驗(yàn)室中常用的根瘤菌培養(yǎng)基耗費(fèi)比較大，工業(yè)中用工業(yè)污泥代替培養(yǎng)基生產(chǎn)根瘤菌，含有充足營養(yǎng)成分的濾泥作為培養(yǎng)基便成了可能[5]。本研究以甘蔗糖廠濾泥作為培養(yǎng)基培養(yǎng)大豆根瘤菌，優(yōu)化了培養(yǎng)條件，確定了固體濾泥可以作為菌體生長的載體，即制成根瘤菌菌劑。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

材料：甘蔗糖廠濾泥，廣西大新縣雷平永鑫糖業(yè)有限公司；大豆根瘤菌，分離自大豆根瘤，遼寧瓦房店農(nóng)場提供；YMA培養(yǎng)基[6]，根瘤菌標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糖廠濾泥成分測定

氮的測定：凱氏定氮法[7]。

糖的測定：3，5－二硝基水楊酸法[6]。

磷的測定：鉬酸銨分光光度法[8]。

金屬元素的測定：原子吸收光譜法[9]。

1.2.2 根瘤菌在不同濕度糖廠濾泥和YMA培養(yǎng)基中的生長曲線

以培養(yǎng)基中菌濁度為指標(biāo)繪制根瘤菌的生長曲線[10]。

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們生活環(huán)境得到了很大改善，此時(shí)，建筑工程為了與這種情況相適應(yīng)，基本建筑形式日漸復(fù)雜，人們對建筑要求也呈現(xiàn)出多樣化趨勢。為此，很多新型施工技術(shù)出現(xiàn)在了項(xiàng)目建設(shè)之中，電氣接地施工技術(shù)便屬于其中之一。施工單位在施工過程中，應(yīng)該以施工質(zhì)量為基礎(chǔ)，在確保建筑安全的同時(shí)，避免群眾生活受到影響。為了滿足這一目標(biāo)，建筑工程內(nèi)部的接地工作同樣顯得十分重要。在該項(xiàng)技術(shù)的作用之下，建筑物在雷雨天氣中的雷擊率也會(huì)大幅下降。但該技術(shù)在使用之前也存在一些前提條件，需確?；炷梁弯摻罱ㄖ┕そY(jié)構(gòu)連接在一起，提升整體建筑的安全系數(shù)[1]。

1.2.3 糖廠濾泥培養(yǎng)根瘤菌條件優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別設(shè)計(jì)各因素梯度，其他條件不變，改變其中一個(gè)條件以分別考察總糖總氮比(mC∶mN)、溫度、pH對大豆根瘤菌生長的影響。以濾泥中糖消耗量作為指標(biāo)來表示生長量大小。各因素水平梯度分別為：mC∶mN，5∶2、10∶7、1∶1、7∶10、2∶5；培養(yǎng)溫度，24、28、32、36、40 ℃；pH，6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；濾泥濕度，65.92%、72.97%、84.85%。分別確定大豆根瘤菌生長的最適條件[11]。

1.2.3.2 響應(yīng)面分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上將濾泥濕度定為72.97%，以培養(yǎng)基濾泥糖消耗量(簡稱耗糖量)為指標(biāo)，以培養(yǎng)溫度(X1)、pH(X2)和培養(yǎng)基總糖總氮比(X3)為因素考察，分別選取3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)作3個(gè)平行取平均值[12－14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 濾泥成分分析

2.1.1 總糖、總氮和總磷

濾泥中總氮、總糖、總磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.64%、12.46%、1.48%。實(shí)驗(yàn)表明，濾泥中含有足夠根瘤菌生長的碳源和氮源，并且糖廠本身在生產(chǎn)中會(huì)有廢糖蜜產(chǎn)出。廢糖蜜中含有成分很高的糖，可以將廢糖蜜加入濾泥中，這樣在實(shí)際中較容易操作。

2.1.2 金屬元素

從表1中可以看出，濾泥中含有足夠多的微量元素。另外，用濾泥作為根瘤菌菌劑不用擔(dān)心重金屬污染的問題，因?yàn)槎箍浦参锓N子的接種量低，引入土壤中的重金屬不足以污染環(huán)境。

表1 濾泥中金屬元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.1 The metal element content of filter mud

2.2 根瘤菌在不同濕度濾泥中的生長曲線

由圖1可知，供試菌在含水72.97%和含水84.85%的濾泥培養(yǎng)基中生長量較大。4個(gè)培養(yǎng)基中供試菌由對數(shù)生長期轉(zhuǎn)入穩(wěn)定生長期的時(shí)間均為18h左右。故可選擇培養(yǎng)18h為測殘?zhí)菚r(shí)間節(jié)點(diǎn)。對2個(gè)優(yōu)勢培養(yǎng)基生長曲線比較分析，從開始的適應(yīng)階段到對數(shù)生長階段2種培養(yǎng)基基本一致，菌體生長量為含水84.85%的培養(yǎng)基稍多，但是其物理性質(zhì)接近液態(tài)。穩(wěn)定期后的衰亡期則是含水72.97%的培養(yǎng)基衰亡較慢。故綜合分析2種培養(yǎng)基，含水72.97%的培養(yǎng)基比較好，實(shí)際應(yīng)用性強(qiáng)，所以單因素實(shí)驗(yàn)采用此培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進(jìn)行優(yōu)化。濾泥中的根瘤菌衰亡要比YMA培養(yǎng)基中的早，原因是濾泥中糖分不是很足，在實(shí)際操作中可以加入糖廠的廢蜜來提高濾泥中的糖度[15]。

圖1 供試菌培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 The growth curve diagram of the bacteria in medium

2.3 濾泥培養(yǎng)根瘤菌條件優(yōu)化及分析

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

總糖總氮比優(yōu)化結(jié)果：由圖2可知，總糖總氮比為7∶10時(shí)，耗糖量最大，生長量最大，而濾泥本身的總糖總氮比約為4∶1，所以在實(shí)際操作中適當(dāng)加入一些含氮量高的物質(zhì)會(huì)更好。

pH優(yōu)化結(jié)果：由圖3可見，在pH 7.5時(shí)耗糖量最大，生長量最大。這個(gè)在實(shí)際操作中很容易實(shí)現(xiàn)，因?yàn)闉V泥本身就接近中性，所以稍加調(diào)整即可達(dá)到所要求條件。

溫度優(yōu)化結(jié)果：由圖4可知，根瘤菌在濾泥中的最佳生長溫度在29℃左右，這個(gè)環(huán)境與室溫25℃差別不是很大，也較易實(shí)現(xiàn)，并且在室溫條件下根瘤菌生長也較好，因此，在實(shí)際操作中很容易達(dá)到條件。2.3.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

以溫度、總糖總氮比和pH為自變量，以耗糖量為因變量，用Design－Expert軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案(表2)并對結(jié)果進(jìn)行分析[15]，結(jié)果見表3。

以耗糖量為響應(yīng)值，根據(jù)表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design－Expert軟件進(jìn)行模擬得二次回歸方程R1＝0.350 800＋0.042 000X1＋0.042 875X2－0.037 708X3＋0.058 917X1X2＋0.011 250X1X3－0.015 333X2X3－0.044 983＋0.065 267－0.022 400。由此知X1(溫度)、X2(pH)、X3(總糖總氮比)、X1X2(溫度與pH的交互作用)對耗糖量的影響顯著。表明實(shí)驗(yàn)因素對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)與響應(yīng)值也有很大關(guān)系。

表2 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼表Tab.2 Box－Behnken coding schedule and the level of experimental factors

表3 Box－Behnken設(shè)計(jì)表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Box－Behnken design table and the experimental result

由表3和圖5分析得出最大耗糖量的工藝條件組合：溫度29℃，pH 7.5，總糖總氮比7∶10。為了檢驗(yàn)所建模型的可行性，分別采用得到的最佳和最劣工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3次平行實(shí)驗(yàn)得到的最佳平均耗糖量為0.498，與理論值相差0.3%(相對誤差1.7%)，效果顯著。

圖5 溫度、總糖總氮比對耗糖量影響的響應(yīng)面圖Fig.5 The response surface of temperature，ratio of total sugar and nitrogen on the consumption of sugar

3 結(jié) 論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和相應(yīng)面分析確定了根瘤菌在濾泥中生長的最佳條件。

糖廠濾泥在菌劑生產(chǎn)中展示了良好的應(yīng)用前景。雖然在可用性、前處理等方面還有待提高，但是它為可持續(xù)發(fā)展以及廢物再利用找到了新的出路。濾泥作為培養(yǎng)基生產(chǎn)菌劑較標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基要節(jié)約成本，對濾泥稍加處理就可以利用，這種全新的方法用于大規(guī)模生產(chǎn)也有望成為現(xiàn)實(shí)。

[1]劉靈芝，陳玉玲，陳志剛，等.北方地區(qū)大豆根瘤菌的生物學(xué)特性[J].土壤通報(bào)，2007，38(1)：141－144.

[2]寧國贊.農(nóng)業(yè)微生物資源在國家經(jīng)濟(jì)及生態(tài)環(huán)境建設(shè)中的重要作用[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2002，4(3)：23－26.

[3]劉保平，周俊初.根瘤菌菌劑研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，45(1)：57－61.

[4]時(shí)全義，劉嬋嬋，王可.工業(yè)污泥用于根瘤菌菌劑生產(chǎn)的新方法[J].上海化工，2009，34(7)：23－26.

[5]RODRlGUEZ－NAVARRO D N，TEMPRANO F，ORVlVE R.Survival ofRhizobiumsp.(Hedysarum coronariuml.)on peat－based inoculants and inoculated seeds[J].Soil Biology and Biochemistry，1991，23(4)：375－379.

[6]高亞梅，韓毅強(qiáng)，王景偉，等.大豆根瘤菌的分離與分子鑒定[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，19(5)：16－19.

[7]劉志國.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].上海：華東科技大學(xué)出版社，2007：31－33，73－77.

[8]司皖蘇，朱伊莙，嚴(yán)剛.固廢中總磷的測定[J].儀器儀表與分析監(jiān)測，2010(2)：42－44.

[9]賈曉軍，程江玲，何鳳儀，等.糖廠濾泥中幾種元素的分析[J].中國甜菜糖業(yè)，2010(1)：7－9.

[9]李永春，孔令如，王淼，等.酸性土壤中大豆優(yōu)勢根瘤菌的分離、鑒定及其生物學(xué)特性[J].中國油料作物學(xué)報(bào)，2011，33(4)：384－390.

[10]李鄭軍，許修宏.不同地區(qū)大豆根瘤菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40(11)：11－13.

[11]KIM J H，YOO S J，OH D K.Selection of aStreptococcusequimutant and optimization of culture conditions for the production of high molecular weight hyaluronic acid[J].Enzyme and Microbial Technology，1996，19(6)：440－445.

[12]高先軍.響應(yīng)面法優(yōu)化Paracin 1.7發(fā)酵條件及其產(chǎn)生菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步建立[D].哈爾濱：黑龍江大學(xué)，2010：28－30.

[13]杜連祥，路福平.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2005：35－37.

[14]張彧，聶艷玲，張曉娟，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化牛蒡胡蘿卜素的提取工藝[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28(6)：397－400.(ZHANG Yu，NIE Yan－ling，ZHANG Xiao－juan，et al.Optimization for carotene extraction from the roots ofArctiumlappaL.by response surface method[J].Journal of Dalian Polytechnic University，2009，28(6)：397－400.)

[15]PALANIVEL R，KOSHY MATHEWS P.Prediction and optimization of process parameter of friction stir welded AA5083－H111aluminum alloy using response surface methodology[J].Journal of Central South University of Technology，2012，19(1)：1－8.