響應(yīng)面法優(yōu)化釀酒酵母高產(chǎn)谷胱甘肽的發(fā)酵條件

欒 靜，趙 長 新，俞 志 敏

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由 L－谷氨酸、L－半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的一種生物活性三肽化合物[1]，在生物體內(nèi)有著多種重要的生理功能，特別是對(duì)于維持生物體內(nèi)適宜的氧化還原環(huán)境起著至關(guān)重要的作用[2]。

GSH的生產(chǎn)方法主要有溶劑萃取法、化學(xué)合成法和發(fā)酵法[3]。萃取法是從動(dòng)植物組織中進(jìn)行GSH的分離提取，其制取GSH純度和收率不高，因此該法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不大[4]。化學(xué)合成法生產(chǎn)GSH的反應(yīng)步驟多、反應(yīng)時(shí)間長、分離純化困難且易造成環(huán)境污染[5]。因此，目前GSH的主要生產(chǎn)方法是酵母菌發(fā)酵。但是，普通酵母生產(chǎn)GSH的能力有限，必須經(jīng)過菌株選育和發(fā)酵條件優(yōu)化。培養(yǎng)基組成和環(huán)境條件對(duì)細(xì)胞生長和單位細(xì)胞GSH合成能力都有重要影響，因此要提高微生物生產(chǎn)GSH總量，必須對(duì)培養(yǎng)基組成和環(huán)境條件進(jìn)行優(yōu)化[6－7]。本研究的前期工作已獲得了一株具有ZnCl2和半胱氨酸抗性的高產(chǎn)GSH釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)YZM14[8]，在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用 Plackett－Burman設(shè)計(jì)、Box－Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對(duì)培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件來提高GSH產(chǎn)量，以期為GSH工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YZM14：大連工業(yè)大學(xué)微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g／L)：葡萄糖20，酵母膏 20，(NH4)2SO45，自然pH。

無機(jī)發(fā)酵培養(yǎng)基(g／L)：葡萄糖20，(NH4)2SO420，KH2PO410，MgSO4·7H2O 4，CaCO35，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，pH 6.0。

培養(yǎng)基于0.1MPa、121℃滅菌20min。

1.3 培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)：接種一環(huán)斜面活化菌株至種子培養(yǎng)基中，30℃、150r／min培養(yǎng)20h。

發(fā)酵培養(yǎng)：種子液按5mL接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(裝于250mL三角瓶中)，30℃、150r／min培養(yǎng)24h。

菌株保藏：菌種斜面于4℃冰箱保藏。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量的檢測(cè)

取10mL發(fā)酵液4 000r／min離心10min，收集菌體，用去離子水洗滌2次，收集菌體，在80℃下恒溫烘干至恒重。

1.4.2 胞內(nèi)谷胱甘肽的提取

取10mL發(fā)酵液4 000r／min離心10min，收集菌體，加入一定量(20mL／g干細(xì)胞)體積分?jǐn)?shù)40%的乙醇，30℃提取2h，4 000r／min離心收集上清液，即為GSH提取液。

1.4.3 谷胱甘肽的檢測(cè)

采用 ALLOXAN 法[8]。

1.4.4 谷胱甘肽產(chǎn)量計(jì)算方法

GSH產(chǎn)量(mg／L)＝胞內(nèi) GSH 質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg／g)×菌體干重(g／L)。

1.5 響應(yīng)面分析方法

以GSH產(chǎn)量作為響應(yīng)值，通過3個(gè)步驟進(jìn)行優(yōu)化。(1)利用Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出對(duì)GSH產(chǎn)量影響顯著的因素，各因素水平設(shè)計(jì)見表1；(2)利用最陡爬坡試驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域；(3)利用響應(yīng)面法中的Box－Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，通過對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)面模型，最終確定最優(yōu)發(fā)酵條件，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)[9－10]。

表1 Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及試驗(yàn)結(jié)果(N＝12)Tab.1 Plackett－Burman experiment and results(N＝12)

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)法篩選重要因素

本試驗(yàn)以GSH產(chǎn)量作為響應(yīng)值，選擇培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件中的9個(gè)因素作為考察對(duì)象，即葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X1)，%；酵母膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X2)，%；(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X3)，%；MgSO4·7H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X4)，%；KH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X5)，%；初始pH(X6)；裝液量(X7)，mL；發(fā)酵時(shí)間(X8)，h和發(fā)酵溫度(X9)，℃。采用試驗(yàn)次數(shù)N＝12的Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，各因素水平及試驗(yàn)結(jié)果見表1。

由表2可知，在所考察的9個(gè)因素中，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酵母膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)和初始pH對(duì)GSH產(chǎn)量的影響最為顯著，三者均為正效應(yīng)，應(yīng)增加。在后續(xù)的試驗(yàn)中將對(duì)這3個(gè)因素做進(jìn)一步的優(yōu)化。其他各因素的水平調(diào)整如下：(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、裝液量為250mL三角瓶裝50mL和發(fā)酵溫度為28℃、MgSO4·7H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、KH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、發(fā)酵時(shí)間36h，且在后續(xù)試驗(yàn)中將不再改變。

通過逐步回歸分析，獲得該菌發(fā)酵生產(chǎn)GSH的多元一次回歸方程為：

式(1)中：Y為GSH產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值。該模型相關(guān)系數(shù)R2＝0.995 6，該模型相關(guān)性良好。

表2 Plackett－Burman試驗(yàn)中影響GSH產(chǎn)量各因素的效應(yīng)分析Tab.2 Effect analyses of the production of GSH from Plackett－Burman design

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)式(1)中回歸系數(shù)的大小和符號(hào)，確定最陡爬坡試驗(yàn)中3個(gè)顯著因素變化的大小和方向，其他因素水平為Plackett－Burman試驗(yàn)調(diào)整后的值。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.3 Experimental design and results of steepest ascent

由表3可以看出，最高GSH產(chǎn)量出現(xiàn)在步驟4，因此選擇它作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

以葡萄糖糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、酵母膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)和初始pH(C)為自變量，以GSH產(chǎn)量為響應(yīng)值，采用Box－Behnken設(shè)計(jì)對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表4。

利用MINITAB 15軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸，獲得二次方程，如公式(2)：

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。GSH產(chǎn)量與試驗(yàn)3個(gè)因素的回歸方程的F值為163.38，方程顯著?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)為0.990 5，說明因變量與3個(gè)自變量之間的線性關(guān)系顯著，該模型的擬合效果較好。利用該回歸方程確定最優(yōu)的GSH生產(chǎn)條件，用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

表4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Tab.4 Design and results of RSM analysis

表5 回歸方程的方差分析和回歸系數(shù)顯著性分析表Tab.5 Regression coefficients and their significance of the quadratic model

圖1、2和3直觀地反映了各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。比較3組圖可知，葡萄糖和酵母膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)GSH產(chǎn)量影響較為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，初始pH對(duì)GSH產(chǎn)量影響不顯著，表現(xiàn)為曲線較為平緩，隨著其數(shù)值的變化，GSH產(chǎn)量沒有顯著的變化。

圖1 葡萄糖濃度(A)和酵母膏濃度(B)對(duì)GSH產(chǎn)量(Y)影響的三維圖Fig.1 3Dmap of effect of GSH production (Y)versus content of glucose(A)and content of yeast extract(B)

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，可得到如下3個(gè)方程：

解得A＝0.088，B＝0.066，C＝－0.20，即釀酒酵母最優(yōu)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為：葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.544%，酵母膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.033%和初始pH為5.88，確定GSH最大產(chǎn)量為124.27mg／L。為檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采取響應(yīng)面分析法求得的最佳條件進(jìn)行試驗(yàn)，得出GSH產(chǎn)量為125.42mg／L，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。

3 結(jié) 論

響應(yīng)面分析法對(duì)S.cerevisiaeYZM－14合成GSH培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果為：葡萄糖2.54%，酵母膏1.03%，(NH4)2SO40.5%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.1%，初始pH 5.88，裝液量為250mL三角瓶裝50mL，發(fā)酵溫度28℃和發(fā)酵時(shí)間36h。在此條件下，GSH產(chǎn)量為125.42mg／L，比無機(jī)發(fā)酵培養(yǎng)基提高了75.37%。

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