RP－HPLC測(cè)定人參莖葉總皂苷及不同部位浸膏中Rb3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

馬 暢，申 貴 雋，李 珂 珂，陳 麗 榮，弓 曉 杰

(1.大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622)

0 引 言

人參(PanaxginsengC.A.Meyer)系五加科(Araliaceae)人參屬(Panax)植物，是特產(chǎn)于我國(guó)的一味珍貴藥材。研究表明，人參皂苷是人參的主要有效成分[1－3]。人參屬植物中人參皂苷的種類和含量存在較大的差異，其各部位中所含皂苷的種類、含量也不相同。人參莖葉中含有大量的人參總皂苷(約7%～16%)，人參莖葉是一種可再生資源，可充分作為人參皂苷制備的原材料，且皂苷成分和藥理活性與人參根總皂苷相似[4]。人參皂苷Rb3具有廣泛的生理活性，如抗血小板、抗血栓作用，對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷的保護(hù)作 用 等[5－6]。 人參皂苷的分離及分析方法較多[7－8]，本研究采用 RP－HPLC法對(duì)人參不同部位浸膏及莖葉總皂苷中人參皂苷Rb3進(jìn)行定性定量分析，以期構(gòu)建分離度好、準(zhǔn)確、快捷的人參皂苷Rb3含量測(cè)定方法，為開(kāi)發(fā)以人參皂苷Rb3為主的創(chuàng)新藥物提供科學(xué)依據(jù)，為人參莖葉成分及藥理活性研究及藥材的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters 600高效液相色譜系統(tǒng)：Waters 600泵，Waters 2487多通道紫外檢測(cè)器，N2000色譜工作站；TGL－169高速離心機(jī)。

人參莖葉總皂苷；人參果浸膏；人參莖葉浸膏；人參須根浸膏；人參根浸膏；人參皂苷對(duì)照品Rb3；甲醇，色譜純；磷酸，分析純；實(shí)驗(yàn)用水，純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱，Nava－Pak?－C18(3.9mm×150mm，4μm)；流動(dòng)相，甲醇－水－磷酸[V(甲醇)∶V(水)∶V(磷酸)＝65∶35∶1]；體積流量，1.0mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)，203nm；進(jìn)樣量，20μL。此條件下人參莖葉總皂苷及對(duì)照品Rb3色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 樣品溶液的制備

精確稱取樣品(人參莖葉總皂苷)，置于10mL容量瓶中，甲醇溶解超聲助溶，定容，高速離心20min(1 600r／min)，取上清液用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液即為樣品液，備用。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精確稱取人參皂苷Rb3對(duì)照品4.0mg，置于10mL容量瓶中甲醇定容至刻度。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾待用。

2.4 線性關(guān)系考察

精確吸取對(duì)照品溶液，分別稀釋制成0.04、0.10、0.20、0.40、1.00mg／mL的溶液。分別吸取上述溶液按照“2.1”的色譜條件進(jìn)行色譜分析。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，得回歸方程Y＝445 193.311 3X－175 865.197 1，R＝0.999 9。結(jié)果表明，進(jìn)樣量在0.8～20μg具有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精確吸取濃度為0.40mg／mL的人參皂苷Rb3對(duì)照品溶液20μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，得峰面積的RSD為3.32%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精確吸取同一份人參莖葉總皂苷樣品溶液，每隔2h進(jìn)樣一次，進(jìn)樣6次，得峰面積的RSD為1.52%，結(jié)果表明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精確稱取同一批人參莖葉總皂苷樣品5份，制備樣品溶液，按色譜條件測(cè)得峰面積RSD為1.39%(n＝5)，此結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好，方法可行。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精確稱取人參莖葉總皂苷樣品6份，分別加入人參皂苷Rb3對(duì)照品適量，制備樣品溶液，測(cè)得平均加樣回收率為100.3%，樣品峰面積RSD為2.65%，此結(jié)果表明該方法的回收率較好，方法可行。

2.9 樣品測(cè)定

按“2.2”處理樣品，吸取樣品液20μL進(jìn)樣，按“2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖2～5。用隨機(jī)外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品中人參皂苷Rb3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.1 Determination of ginsenoside Rb3in different samples

3 結(jié) 論

(1)建立的反相高效液相色譜法測(cè)定人參果浸膏、人參莖葉浸膏、人參須根浸膏、人參根浸膏及人參莖葉總皂苷中人參皂苷Rb3，方法簡(jiǎn)便、快速，而且穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，可以為人參的質(zhì)量控制提供參考。

(2)實(shí)驗(yàn)曾采用甲醇－水－冰醋酸、甲醇－水－磷酸2種流動(dòng)相，其中加酸的主要作用是調(diào)整峰型，通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較冰醋酸和磷酸，發(fā)現(xiàn)磷酸較好，峰型較理想。柱溫和體積流量對(duì)分離度的影響較大，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，以柱溫25℃、體積流量1.0mL／min為佳。

(3)人參不同部位浸膏中人參皂苷Rb3含量測(cè)定結(jié)果表明，人參果浸膏及人參莖葉浸膏中人參皂苷Rb3含量明顯高于人參須根浸膏及人參根浸膏。因此，人參皂苷Rb3在人參地上部分含量更高，人參地上部分與地下部分藥理活性有差異，在臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)有所區(qū)別。

(4)人參莖葉每年都大量的生長(zhǎng)，可作為人參皂苷制備的原材料。人參莖葉作為藥用有效部位，其主要生理活性和有效成分人參皂苷的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍需不斷完善，本實(shí)驗(yàn)采用RP－HPLC法，以甲醇－水－磷酸[V(甲醇)∶V(水)∶V(磷酸)＝65∶35∶1]為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm。外標(biāo)法對(duì)人參莖葉總皂苷中人參皂苷Rb3進(jìn)行定性、定量分析，不僅方法簡(jiǎn)捷、分離效果好，也可以為人參莖葉產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。建立與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)相適應(yīng)的中藥質(zhì)量控制方法，對(duì)實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化具有非常重要的意義。

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