人參皂苷Compound K對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞凋亡的影響

蔣 丹 丹，王 晗，王 際 輝，葉 淑 紅，肖 珊

(大連工業(yè)大學(xué) 遼寧省食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116034)

0 引 言

近年來，人們?cè)诓粩嗟貙で笠种颇[瘤的新方法，人參作為我國傳統(tǒng)中藥受到越來越多的關(guān)注[1]。人參的許多生物學(xué)活性都是人參皂苷引起的[2]，目前已發(fā)現(xiàn)人參皂苷有30多種，其中一些稀有人參皂苷具有極高的生理活性[3]。稀有人參皂苷Compound K是其他二醇型人參皂苷在人腸道內(nèi)的降解產(chǎn)物，具有良好的抑制癌細(xì)胞生長的作用[4]。膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的首位，具有晚期惡性度加重和易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)[5]。本實(shí)驗(yàn)探討了人參皂苷Compound K誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

人膀胱癌T24細(xì)胞系；人參皂苷Compound K，大連工業(yè)大學(xué)金鳳燮教授惠贈(zèng)；RPMI 1640培養(yǎng)基；新生小牛血清；MTT；caspase－3、caspase－9單克隆抗體；多功能酶標(biāo)儀(TECAN SUNRISE)；流式細(xì)胞儀(Facscalibur Becton Dickinson)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

將T24細(xì)胞置于37℃、5%飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中，用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清，青霉素100U／mL，鏈霉素100mg／L)培養(yǎng)。細(xì)胞呈單層生長，達(dá)80%左右融合時(shí)傳代，細(xì)胞消化采用0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA混合消化液，每2～3d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×104個(gè)／mL，接種于96孔板中，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。分別培養(yǎng)24、48、72h，換成不含血清培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組各加入不同濃度的人參皂苷Compound K，使其終濃度分別為5、10、15、20、25μmol／L，每種濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h，每孔加入5mg／mL MTT溶液100μL，37℃培養(yǎng)4h后棄培養(yǎng)液，加入150μL DMSO，搖床上振蕩10min，待甲臜結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定每孔光吸收值。

1.4 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

取對(duì)數(shù)生長期的T24細(xì)胞，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。培養(yǎng)24h，加入不同濃度的人參皂苷Compound K，使其終濃度分別為5、10、20μmol／L。繼續(xù)培養(yǎng)24h，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加入含5μg／mL的Hoechst 33342的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃孵育10min。在熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞核的形態(tài)變化。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

利用Annexin V－FITC和PI雙染法對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長期的T24細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)／mL，接種于6孔板內(nèi)，用濃度分別為5、10、15、20、25μmol／L 人參皂苷Compound K作用24h后收集細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，然后利用流式細(xì)胞儀對(duì)Annexin V－FITC細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 免疫印跡法檢測(cè)caspase－3和caspase－9蛋白的表達(dá)

將傳代細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，分別用濃度為5、10、15、20、25μmol／L的人參皂苷 Compound K處理細(xì)胞24h，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。用Bradford法測(cè)定含量后，經(jīng)12%SDS－PAGE處理后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用體積分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉室溫封閉1h，分別加1∶1 000稀釋的抗人caspase－9、caspase－3抗體，4℃ 孵育過夜，洗膜后加1∶2 000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，洗膜后使用ECL試劑進(jìn)行檢測(cè)，Bio－Rad凝膠成像圖像分析系統(tǒng)照相記錄結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 10.0軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，＊P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，＊＊P＜0.01表示差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 人參皂苷Compound K對(duì)T24細(xì)胞存活率的影響

如圖1和2所示，人參皂苷Compound K對(duì)T24細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制效應(yīng)。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著人參皂苷Compound K濃度和作用時(shí)間的增加細(xì)胞存活率明顯下降，呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。

2.2 人參皂苷Compound K誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)

不同濃度人參皂苷Compound K處理T24細(xì)胞24h后，如圖3所示，熒光顯微鏡下可觀察到明顯的凋亡細(xì)胞形態(tài)，即細(xì)胞體積變小，染色質(zhì)凝集、凋亡小體形成、核內(nèi)可見致密的顆粒狀熒光，并呈劑量依賴關(guān)系。對(duì)照組則無明顯的細(xì)胞凋亡特征。

圖3 人參皂苷Compound K處理后T24細(xì)胞形態(tài)觀察(熒光顯微鏡×200)Fig.3 Morphology observation of T24cells treated by ginsenoside Compound K(fluoroscope×200)

2.3 人參皂苷Compound K對(duì)T24細(xì)胞凋亡的作用

不同濃度人參皂苷Compound K處理T24細(xì)胞24h后，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，隨著人參皂苷Compound K濃度的增加(5、10、15、20、25μmol／L)，細(xì)胞凋亡率明顯上升，從11.3%(對(duì)照組)分別上升至14.2%、16.8%、19.6%、94.3%、95.4%。

2.4 人參皂苷Compound K對(duì)T24細(xì)胞caspase－3和caspase－9蛋白表達(dá)的影響

用不同濃度的人參皂苷Compound K對(duì)T24細(xì)胞作用24h后，觀察caspase－3和caspase－9蛋白表達(dá)情況，與對(duì)照組比較。從圖4可以看出，隨著人參皂苷Compound K濃度的增加，與空白對(duì)照組相比，蛋白表達(dá)變化漸趨明顯，caspase－3和caspase－9蛋白表達(dá)水平明顯增高。

圖4 人參皂苷Compound K對(duì)T24細(xì)胞中caspase－9和caspase－3蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Compound K on expression of caspase－9and caspase－3proteins in T24cells

3 結(jié) 論

通過研究人參皂苷Compound K對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的作用發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Compound K能夠抑制T24膀胱癌細(xì)胞生長，誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，呈劑量和時(shí)間依賴性，其作用機(jī)制和caspase蛋白的激活有關(guān)。本研究對(duì)人參皂苷Compound K應(yīng)用于臨床膀胱癌的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，人參皂苷Compound K有望成為一種具有良好應(yīng)用前景的抗癌藥物。

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