野生和半人工養(yǎng)殖東北林蛙生長發(fā)育的比較

周學(xué)紅 楊錫濤 吳 丹

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

東北林蛙(Rana chensinensis)的雌性輸卵管(哈什蟆油)具有藥用價(jià)值，因而被廣泛養(yǎng)殖。其養(yǎng)殖方式分為半人工養(yǎng)殖和全人工養(yǎng)殖兩種:半人工養(yǎng)殖，指在蛙卵孵化以及幼蛙變態(tài)前進(jìn)行人工管理(包括蝌蚪的繁育、飼喂、疾病防控等)，幼蛙上山后人為干預(yù)較少，完全生活在野生環(huán)境中;全人工養(yǎng)殖(圈養(yǎng))，指從野生環(huán)境中獲取蛙卵，在人工環(huán)境中進(jìn)行孵化、變態(tài)，成蛙進(jìn)行人工飼喂活體昆蟲飼料、進(jìn)行人為管理，人工提供冬眠環(huán)境，但這種養(yǎng)殖方式尚處在探索研究與實(shí)踐中。在我國，東北林蛙的養(yǎng)殖以半人工養(yǎng)殖為主，技術(shù)也相對比較成熟。從目前的情況看，林蛙的人工養(yǎng)殖，不僅有利于野生種群的恢復(fù)和生態(tài)平衡的維持，而且有利于當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的發(fā)展[1-5]。

兩棲類動物，由于食物資源、營養(yǎng)狀況和代謝水平的季節(jié)周期性差異，使其生長出現(xiàn)快速發(fā)育期、緩慢發(fā)育期和停滯期的周期性變化。骨骼組織生長過程中，骨膠原纖維和礦物質(zhì)積累的不同，使得骨組織疏密程度不同，從而出現(xiàn)周期性生長的抑制生長線(LAG)。LAG一般在食物短缺的冬眠期間形成，因此骨骼上的每一條LAG對應(yīng)相應(yīng)年份的冬眠期。某一個體骨骼切片上LAG的分布規(guī)律，可以獲得該個體的生長發(fā)育情況;而群體的骨骼切片上LAG的生長規(guī)律，可以反映出群體的總體情況，甚至可以推測出每個個體若干年后的生長發(fā)育變化的動態(tài)信息。骨齡學(xué)研究方法，是基于動物骨骼切片上可數(shù)的LAG進(jìn)行年齡結(jié)構(gòu)分析，可以得出物種的平均壽命、性成熟年齡及生長速率等，因而這一方法被廣泛的應(yīng)用于兩棲類的研究中[6-12]。

野生與半人工養(yǎng)殖狀態(tài)下，林蛙的外部形態(tài)特征或內(nèi)部組織器官的生長，存在一定的差異。為了研究人工因素對林蛙生長發(fā)育的作用，本文應(yīng)用骨齡學(xué)方法，比較了野生和半人工養(yǎng)殖林蛙發(fā)育的差異性。在對野生和半人工養(yǎng)殖林蛙進(jìn)行年齡鑒定的基礎(chǔ)上，對林蛙的體長、體質(zhì)量、趾骨直徑、生長速率和趾骨切面的各LAG直徑的相對生長速率進(jìn)行了差異性比較;并進(jìn)一步研究了東北林蛙半人工養(yǎng)殖條件下，人為因素對林蛙生長發(fā)育的影響。

1 材料與方法

2010年10月份，在吉林省長白山地區(qū)半人工養(yǎng)殖區(qū)域的采樣地 1(N42°20'，E128°09')和采樣地2(N42°14'，E128°10')取林蛙共 184 只(雄蛙 89 只，雌蛙95只)，在距半人工養(yǎng)殖區(qū)域不遠(yuǎn)處的樣地3(N42°21'，E128°05')取野生林蛙 125 只(雄蛙 56只，雌蛙69只)。

每個采樣地各取40個樣方(1 m×1 m)，每隔200 m取1個，調(diào)查草本蓋度、落葉層厚度和郁閉度，同時(shí)收集林蛙半人工養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)管理信息，如飼料配方、水溫調(diào)控方法等。

將林蛙帶回實(shí)驗(yàn)室后，濾紙擦拭林蛙，電子天平稱其活體體質(zhì)量，精確至0.01 g;游標(biāo)卡尺測量其體長(從吻端至泄殖孔緣的距離)，精確至0.02 mm;根據(jù)拇指是否有婚墊進(jìn)行性別區(qū)分。林蛙右后腿第三趾骨的第二骨塊離體標(biāo)號后，去除皮膚肌肉組織，用10%的生理甲醛溶液固定2 h，10%的生理硝酸溶液脫鈣36 h，流水沖洗24 h。50%、75%、85%、95%和100%的乙醇梯度脫水各80 min，二甲苯乙醇溶液(體積比1∶1)、二甲苯溶液中透明2次各30 min，二甲苯石蠟溶液(體積比1∶1)中1 h以除去二甲苯，石蠟油中2次(每次15 min)以進(jìn)一步除去二甲苯，石蠟包埋。用手搖切片機(jī)把骨塊切成7 μm，二甲苯溶液脫蠟2次，100%、95%、75%、50%的乙醇溶液復(fù)水各3 min，恒溫箱內(nèi)(50℃)Ehrlich酸性蘇木精溶液染色1 h。切片在20倍物鏡下，由兩人確定LAG的數(shù)目。用精度為1 μm的顯微測微尺測量各個LAG的最大直徑和最小直徑，其幾何平均數(shù)作為 LAG 的直徑[13]。

林蛙生長速率的計(jì)算參照von Bertalanffy’s方程，St=Sm-(Sm-S0)e-k(t-t0)。式中:St為 t年齡時(shí)的體長，Sm為最大體長，S0為變態(tài)時(shí)的體長(12 mm)，t0為變態(tài)時(shí)的年齡(0.125 a)，k為增長速率。

建立林蛙趾骨LAG直徑相對增長率的計(jì)算方法:設(shè)林蛙的年齡(t)與趾骨LAG直徑(R)具有函數(shù)關(guān)系f(t)，趾骨LAG直徑的相對增長率為r，且在Δt的時(shí)間內(nèi)，r值變化很小，由于趾骨的生長連續(xù)性(即f(t)可微)，變態(tài)時(shí)林蛙年齡為t0，則f(t0)=R0。由假設(shè)得，對任意時(shí)間 Δt＞0，都有[t，t+Δt]，LAG 直徑的增量為f(t+Δt)-f(t)。由微分定義得:[f(t+Δt)-f(t)]/Δt=rf(t)，令 Δt→0，得微分方程 dy/dt=rf(t)，求積分得f(t)=R0ert?？傻肔AGn對 LAGn-1的相對增長率為r=ln[f(t)/f(t-1)]。

對野生和半人工養(yǎng)殖林蛙的體長、體質(zhì)量、趾骨直徑和趾骨LAG直徑相對生長速率的均值進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 年齡鑒定

根據(jù)前期研究工作可知[13]，在野生林蛙中共25個樣本(20%)、養(yǎng)殖林蛙中共31個樣本(16.85%)存在重吸收和LAG模糊現(xiàn)象，這些個體不參與統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)把林蛙分成6個年齡組(見表1)。

表1 各年齡段林蛙樣本分布表 只

2.2 林蛙生長發(fā)育情況的比較

兩棲類生長發(fā)育過程中，各組織器官之間的發(fā)育具有關(guān)聯(lián)性，可以利用某器官的生長狀態(tài)來反映個體的發(fā)育情況。由于骨骼生長的特殊性，LAG的規(guī)律性變化可以反映出林蛙生長發(fā)育的情況。通過線性回歸分析(見表2)得出:林蛙的體長與趾骨直徑、體長與體質(zhì)量間存在較強(qiáng)的相關(guān)性(p＜0.001)，體長、體質(zhì)量隨趾骨直徑的增加而呈相應(yīng)的規(guī)律性增加，因此可利用趾骨的生長情況來衡量林蛙個體的生長情況。

表2 林蛙體長與趾骨直徑、體質(zhì)量的相關(guān)性

對野生和半人工養(yǎng)殖林蛙的體長、體質(zhì)量、趾骨直徑均值進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)后，得出(見表3):無論雌雄，野生林蛙的體長、體質(zhì)量均值，都顯著小于半人工養(yǎng)殖林蛙的(p＜0.05);野生林蛙的趾骨直徑小于半人工養(yǎng)殖林蛙的，但差異不顯著(p＞0.1)。

2.3 林蛙生長速率比較

從林蛙種群的自然生長速率可以推斷出種群的生長情況，可進(jìn)一步反映林蛙各個時(shí)期的生長特點(diǎn)。由von Bertalanffy’s方程得到林蛙生長速率和最大體長(見表4)。在95%的檢驗(yàn)水平下，無論是野生種群還是半人工養(yǎng)殖種群，雌蛙的生長速率小于雄蛙的生長速率(見圖1、圖2)。雌性半人工養(yǎng)殖林蛙的生長率均大于雌性野生林蛙的生長率，雄性半人工養(yǎng)殖林蛙的生長率大于雄性野生林蛙的生長率。

表3 體質(zhì)量、體長、趾骨直徑差異比較

表4 林蛙生長速率(k)、最大體長(Sm)值的比較

圖1 野生林蛙年齡與體長的關(guān)系

2.4 林蛙趾骨LAG直徑相對生長速率的比較

林蛙個體趾骨LAG的生長可以反映出營養(yǎng)對趾骨的生長作用，群體骨骼LAG的生長規(guī)律可以推測出群體生長發(fā)育的動態(tài)變化。為了比較野生和半人工因素對其生長的影響，對林蛙趾骨LAG直徑的相對生長速率的均值進(jìn)行了兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(見表5)。2齡半人工養(yǎng)殖林蛙的LAG2對LAG1的相對生長速率大于2齡野生林蛙的(P=0.095＜0.1);3齡～5齡半人工養(yǎng)殖林蛙的LAG2對LAG1的相對生長速率也大于野生林蛙的。由此可知，人工因素的干擾對幼趾骨生長作用較大。相同年齡組的林蛙，LAGn對LAGn-1的相對生長速率，半人工養(yǎng)殖林蛙的均大于野生林蛙的;最外層LAG直徑對次外層LAG直徑的相對生長速率，半人工養(yǎng)殖林蛙的也大于野生林蛙的;由此證明，上年趾骨的生長影響了下一年趾骨的發(fā)育。

圖2 半人工養(yǎng)殖林蛙年齡與體長的關(guān)系

表5 林蛙趾骨LAGn對LAGn-1的相對生長速率

2.5 采樣地自然環(huán)境比較

林蛙的生長發(fā)育等受環(huán)境因子的影響比較大，采用樣方法對3個采樣地的草本蓋度、郁閉度和落葉層厚度調(diào)查結(jié)果(見表6)可知，半人工養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)(采樣地1、采樣地2)的落葉層厚度無顯著差異(P=0.644)。但草本蓋度及郁閉度差異極顯著(P=0.001，P=0)。

表6 采樣地草本蓋度、郁閉度、落葉層厚度比較

3 討論

在半人工養(yǎng)殖環(huán)境中，雖然林蛙生活在野生自然環(huán)境中，但是半人工的飼養(yǎng)管理的作用，在一定成度上使得林蛙體長、體質(zhì)量和生長速率等與野生林蛙的存在著差異性。本研究結(jié)果表明:半人工養(yǎng)殖林蛙的體長、體質(zhì)量、生長速率和趾骨LAG直徑相對生長速率，均大于野生林蛙的。

半人工養(yǎng)殖林蛙的生長優(yōu)于野生林蛙的因素，主要來源三方面:政府政策、林蛙生活自然環(huán)境和人工飼養(yǎng)管理。

3.1 政府政策的積極作用

在我國，為了既促進(jìn)林蛙野生資源的保護(hù)，又滿足社會對林蛙的需求，各級政府公布林蛙飼養(yǎng)管理的法律法規(guī)(如白山市林蛙養(yǎng)殖經(jīng)營管理暫行規(guī)定、吉林長白山中國林蛙油質(zhì)量鑒定標(biāo)準(zhǔn)等)，并采取林蛙養(yǎng)殖區(qū)域承包責(zé)任制(部分養(yǎng)殖區(qū)域承包年限在10 a左右，有的甚至是終生承包);中國養(yǎng)殖協(xié)會定期開展林蛙飼養(yǎng)管理技術(shù)培訓(xùn)。林蛙養(yǎng)殖投資少，收益大，采樣養(yǎng)殖戶2008、2009年的年均收入10000元左右，而吉林省農(nóng)民2008、2009年的年均收入分別是4932元和5265元(2010年中國統(tǒng)計(jì)年鑒)，提高了養(yǎng)殖戶的積極性，從而加大了對林蛙的飼養(yǎng)管理，促進(jìn)了林蛙養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

3.2 林蛙生活環(huán)境的影響

對采樣地自然環(huán)境調(diào)查結(jié)果表明，植被類型均為針闊混交林，雖然野生林蛙生活的森林郁閉度與人工養(yǎng)殖區(qū)域相差無幾，但草本蓋度和落葉層厚度小于半人工養(yǎng)殖區(qū)域的(見表6)。半人工養(yǎng)殖林蛙生活的自然環(huán)境優(yōu)于野生林蛙生活的自然環(huán)境，這與半人工養(yǎng)殖區(qū)域承包到個人，有效地促進(jìn)了養(yǎng)殖戶對承包區(qū)域內(nèi)植被的保護(hù)有關(guān)。自然環(huán)境是影響林蛙生長發(fā)育的因素之一，這一觀點(diǎn)與劉欣[14]、邱寶鴻[15]相同;張利萍[16]認(rèn)為，對林蛙分布影響最大的是林分類型，其次是落葉層厚度。林分類型決定了落葉層的厚度，而厚度利于林蛙躲避天敵和節(jié)肢動物的生存，為林蛙提供足量的食物，從而促進(jìn)了林蛙的生長。

3.3 林蛙飼養(yǎng)管理的影響

林蛙的半人工養(yǎng)殖，蝌蚪期的管理至關(guān)重要，不僅影響蝌蚪的成活率和體質(zhì)體況等，還關(guān)系到幼蛙的成活率和性成熟的早晚;因此，蝌蚪變態(tài)前的體質(zhì)量是衡量其發(fā)育是否良好的主要標(biāo)準(zhǔn)之一，體質(zhì)量越大，變態(tài)幼蛙的體質(zhì)量也越大，越有利于幼蛙以后的生長發(fā)育[3]。影響林蛙蝌蚪生長發(fā)育的因素包括營養(yǎng)、溫度和密度等[17]。

林蛙蝌蚪在不同的生長階段，對食物和營養(yǎng)的需求各不相同。蔣朝光[18]認(rèn)為，蛋白質(zhì)總供量是制約林蛙發(fā)育歷程的主要因素，只要滿足了一定量的總蛋白，即使飼料單一，也不會影響林蛙的發(fā)育;崔明勛[17]報(bào)道了動物性飼料更有利于林蛙蝌蚪的生長發(fā)育。而霍洪亮[19]認(rèn)為，植物性飼料和動物性飼料的混合飼料更能加快蝌蚪的發(fā)育;衛(wèi)功慶[20]、王忠艷[21]、田秀華[3]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了，混合性飼料較單純植物性飼料和單純動物性飼料更有利于蝌蚪生長發(fā)育。因此，食物營養(yǎng)是蝌蚪成活率的限制因子，也影響著蝌蚪的變態(tài)率和幼蛙的成活率[17]。如果飼料或營養(yǎng)不足，蝌蚪互食，生長緩慢;飼料或營養(yǎng)過剩，易造成飼料浪費(fèi)、蝌蚪不變態(tài)。實(shí)踐中，林蛙養(yǎng)殖戶在蝌蚪期會適量的添加由食鹽、玉米面、青菜葉和少量動物內(nèi)臟等組成的混合飼料，以保證蝌蚪發(fā)育的營養(yǎng)需要。

但是，溫度在一定程度上也影響了林蛙的生長發(fā)育。崔明勛[17]、王立志[22]報(bào)道了林蛙蝌蚪生長的適宜溫度為25℃，在此溫度下，蝌蚪的體質(zhì)量和變態(tài)率是最高的;而溫度過低，蝌蚪生長緩慢，過高則會使水體缺氧、性比失衡，出現(xiàn)雄多雌少的現(xiàn)象。實(shí)踐中，養(yǎng)殖戶通過在變態(tài)池底鋪塑料膜，在池邊放置樹枝或采用進(jìn)出水的方法來調(diào)節(jié)溫度。

4 結(jié)論

半人工養(yǎng)殖林蛙的體長、體質(zhì)量均值都極顯著的大于野生林蛙的，半人工養(yǎng)殖林蛙的趾骨直徑大于野生林蛙的，但差異不顯著;由von Bertalanffy's方程得到半人工養(yǎng)殖林蛙的k值大于野生林蛙的;由林蛙趾骨直徑相對增長率的計(jì)算方程可知，相同年齡組的林蛙的LAGn對LAGn-1的相對生長速率，半人工養(yǎng)殖林蛙的大于野生林蛙的。半人工養(yǎng)殖林蛙生長發(fā)育優(yōu)于野生林蛙的因素，包括政府政策、生活環(huán)境和飼養(yǎng)管理3個方面。引起半人工養(yǎng)殖林蛙與野生林蛙生長的差異性，除上述因素外，是否與種源、遺傳等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步的研究。

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