AM251對糖尿病腦病大鼠認(rèn)知功能和海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的影響

洪 艷 李 偉 趙 猛 (徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇 徐州 22002)

糖尿病腦病是由于糖尿病糖代謝紊亂導(dǎo)致腦血管改變，損害了中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使大腦在結(jié)構(gòu)、神經(jīng)生理及神經(jīng)精神等方面發(fā)生病理改變，以獲得性認(rèn)知行為缺陷為特征的糖尿病慢性并發(fā)癥，是近幾年受到研究者重視的糖尿病慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，其機制可能為導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性的增加和抑制性的減少，造成神經(jīng)元的興奮性毒作用〔1〕。海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞突觸膜上的AMPA受體介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性突觸傳遞，介導(dǎo)興奮性損傷〔2〕。本實驗通過選用CB1選擇性拮抗劑AM251對1型糖尿病腦病大鼠進行干預(yù)，該干預(yù)措施如果能使AMPA受體相關(guān)蛋白N-乙基順丁烯二酰亞胺敏感性的融合蛋白(NSF)及凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達水平下降，說明其對腦神經(jīng)元的損害起到一定的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組、建模及干預(yù)方法 清潔級成年健康雄性SD大鼠30只(體重200～220 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)。隨機分成3組:正常對照組10只(N組)，糖尿病組20只。糖尿病組通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)65 mg/kg建立1型糖尿病腦病模型。正常對照組用常規(guī)飼料喂養(yǎng)4 w，3 ml 0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液腹腔注射，再喂養(yǎng)12 w;模型組高脂高糖飼料喂養(yǎng)4 w，65 mg/kg STZ腹腔注射喂養(yǎng)4 w后測血糖，血糖＞16.7 mmol/L判斷為成模，以上大鼠均在相同環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲水、覓食。成模大鼠20只，隨機分成2組:糖尿病腦病組(D組)和AM251干預(yù)組(A組)各10只。成模8 w后A組給予AM251腹腔注射0.5 mg·kg-1·d-1，干預(yù)4 w。N組和糖尿病組同期給予等量Tris緩沖液(pH7.4)腹腔注射4 w。

1.2 主要試劑 STZ購自Sigma公司，AM251購自北京寶希迪科技有限公司，NSF抗體購自上海寶曼生物科技有限公司。

1.3 標(biāo)本的采集和保存 喂養(yǎng)16 w以后，Y迷宮檢測學(xué)習(xí)記憶能力，在10%水合氯醛麻醉下，斷頭取腦，在冰上快速剝離出兩側(cè)海馬組織，一側(cè)置于1.5 ml EP管中置于-80℃冰箱凍存，用于Western印跡免疫印記實驗;一側(cè)用10%甲醛固定，用于免疫組織化學(xué)染色。

1.4 Y迷宮行為測試 Y-迷宮的控制儀有電壓控制按鈕、延時控制按鈕、自動控制按鈕和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、0四個按鈕，當(dāng)分別按下I、Ⅱ、Ⅲ按鈕時，相應(yīng)臂的信號燈亮，此時該臂不通電為安全區(qū)(紅燈區(qū))，另外無燈光的兩臂及交界區(qū)均通電而成為非安全區(qū)(電擊區(qū))。按下0按鈕，則三臂均不通電，但交界區(qū)通電。信號燈亮后，稍停片刻電柵才開始通電，這一短暫的間歇期由延時控制按鈕調(diào)節(jié)。將大鼠放入迷宮箱某一臂，適應(yīng)環(huán)境2～3 min后通電電擊，致其一次性逃避至安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯誤反應(yīng)，先進行學(xué)習(xí)，學(xué)會后記錄其在30次電擊中的正確次數(shù)。

1.5 檢測細(xì)胞凋亡 將海馬組織用PBS洗3次后于4%的多聚甲醛中固定25 min，采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況。所用試劑盒為南京凱基生物有限公司提供。將用蛋白酶K消化后的切片用TUNEL液覆蓋，37℃下孵育90 min;SSC終止反應(yīng)，抗HRP抗體常溫孵育15 min，PBS洗凈，DAB呈色。光鏡下凋亡細(xì)胞呈深淺不一的棕黃色。凋亡細(xì)胞半定量分析:根據(jù)凋亡細(xì)胞分布情況在400倍光鏡下，每組切片拍攝5個陽性視野，每個視野計數(shù)100個凋亡的細(xì)胞，以計算平均凋亡細(xì)胞數(shù)所占百分比作為凋亡指數(shù)。

1.6 Western印跡檢測NSF蛋白表達 新鮮海馬稱重后置于1.5 ml EP管中，加入勻漿液，于冰上充分勻漿，4℃、12 000 r/min離心5 min，棄沉淀，取上清，采用Folin測定總蛋白濃度后分裝，-80℃凍存?zhèn)溆?。采?0% 的分離膠，5%的濃縮膠，上樣后80 V恒壓電泳約20 min溴酚藍(lán)至濃縮膠與分離膠交界處，換恒壓100V電泳2 h，使溴酚藍(lán)全部電泳出分離膠底部，裁膠，半干轉(zhuǎn)法將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，恒流80 mA，70 min后取出NC膜，放入封閉液中，搖床封閉1 h。然后加入抗NSF抗體染膜進行一抗孵育過夜(4℃)。再加入相應(yīng)的熒光二抗，避光靜置1 h，Washing Buffer中避光搖床5 min×3次，計算機掃描紀(jì)錄結(jié)果。

1.7 免疫組織化學(xué)檢測NSF蛋白 石蠟包埋切片后先后放入二甲苯、乙醇Ⅰ、乙醇Ⅱ中進行脫蠟，雙蒸水沖洗浸泡5 min×2次，微波爐中進行抗原修復(fù)，冷卻后 PBS沖洗，3%H2O237℃ 10 min，雙蒸水沖洗5 min×3次，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加試劑A，加入一抗4℃過夜，復(fù)溫后先后加入試劑B、C，PBS沖洗，DAB顯色，自來水沖洗后蘇木素復(fù)染，不同濃度的乙醇脫水，加入二甲苯透明，最后封片，讀片。

2 結(jié)果

2.1 Y迷宮試驗結(jié)果 30次Y迷宮檢測實驗，1型糖尿病腦病大鼠的認(rèn)知水平與N組相比明顯下降〔(11.24±1.41)次 vs(3.12±0.27)次，P＜0.05〕，但是當(dāng)用 AM251治療后的大鼠(A組)與D組相比，認(rèn)知水平有了很明顯的提高〔(8.38±0.85)次，P ＜0.05〕。

2.2 免疫組織化學(xué)法檢測NSF蛋白結(jié)果 海馬CA1區(qū)NSF含量在糖尿病腦病組較正常對照組明顯增加 (P＜0.05)，而AM251治療組與糖尿病腦病組比較，NSF表達減少(P＜0.05)。見圖1，圖2，表1。

表1 各組海馬神經(jīng)元凋亡率及NSF蛋白表達比較(n=5，±s)

表1 各組海馬神經(jīng)元凋亡率及NSF蛋白表達比較(n=5，±s)

與N組比較:1)P＜0.05;與D組比較:2)P＜0.05

組別 凋亡率(%) NSF蛋白(MOD)N組5.43±1.86 0.14±0.03 D組 48.61±7.361) 0.73±0.171)A組 23.34±6.222) 0.35±0.112)

3 討論

糖尿病腦病是指糖尿病引起的認(rèn)知障礙和大腦的神經(jīng)生理及結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶、解決問題的能力下降〔3〕，1型糖尿病認(rèn)知功能損害主要在聯(lián)想記憶和學(xué)習(xí)技能注意力方面〔4〕。糖尿病腦病的發(fā)病機制目前還沒有完全明確，但已發(fā)現(xiàn)糖尿病腦病與大腦缺血、氧化應(yīng)激、非酶性蛋白糖基化、胰島素的副作用以及鈣離子穩(wěn)態(tài)的改變等有關(guān)。糖尿病引起的腦缺血、缺氧可導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性的增加和抑制性的減少，造成神經(jīng)元的興奮性毒作用被認(rèn)為是糖尿病腦病病理機制之一，因此也被作為治療糖尿病腦病的關(guān)鍵靶點。NSF作為最有代表性的AMPA受體突觸體內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白，自Block等〔5〕于1988年首次純化出NSF以來，已被廣泛應(yīng)用于研究中，近年來的研究發(fā)現(xiàn)NSF有很廣泛的組織分布特征，但優(yōu)先表達在神經(jīng)系統(tǒng)，而且在海馬最多，提示其神經(jīng)生理功能〔6〕。由于CB1受體則主要位于腦、脊髓與外周神經(jīng)系統(tǒng)中，與記憶、認(rèn)知、運動控制的調(diào)節(jié)有關(guān)〔7〕，而CB受體I型抑制劑AM251直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，所以表現(xiàn)出的活性也是多樣的。國外報道多見于減肥、戒煙方面;國內(nèi)報道主要關(guān)注改善記憶和認(rèn)知障礙、治療精神疾病方面，因此本實驗使用AM251為干預(yù)措施，觀察其在糖尿病腦病的治療作用〔8〕。

本實驗表明長期糖尿病大鼠存在NSF表達增高，與海馬神經(jīng)元凋亡增多有關(guān)，這可能是導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能下降的原因;表明AM251可能通過降低NSF表達，改善糖尿病造成的海馬神經(jīng)元凋亡，提高治療組大鼠認(rèn)知能力。通過本實驗，我們發(fā)現(xiàn)在長期的糖尿病代謝紊亂可導(dǎo)致糖尿病大鼠NSF表達增多，海馬神經(jīng)元凋亡增多，認(rèn)知能力下降，可能參與糖尿病腦病的發(fā)生發(fā)展過程;而本實驗通過選用CB1選擇性拮抗劑AM251的干預(yù)，使大麻素受體中的1型受體(CB1)抑制從而下調(diào)NSF的表達，減少海馬神經(jīng)元凋亡，改善其認(rèn)知功能，從而發(fā)揮治療糖尿病腦病的作用。

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6 Puschel AW，Oconnor V，Betz H.The N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein(NSF)is preferentially expressed in the nervous system〔J〕.FEBS Lett，1994;347(1):55-8.

7 Pertwee RG.The pharmacology of cannabinoid receptors and their ligands:an overview〔J〕.Int J Obesity，2006;30(4):13-8.

8 Hou LC，Li N，Zheng LN，et al.CB1 cannabinoid receptor participates in the vascular hyporeactivity resulting from hemorrhagic shock in rats〔J〕.Chin Med J，2009;122(8):950-4.