海南地區(qū)APM-1基因多態(tài)性與腦梗死患者血清脂聯(lián)素水平的相關(guān)性

何 平 丁毅鵬 陳曉玲 (海南省人民醫(yī)院急救中心，海南 海口 570311)

在缺血性腦卒中類型中動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死(ACI)則較為常見〔1，2〕。研究證實(shí)在腦卒中的發(fā)病過程中遺傳因素起著重要的作用，因而尋找其易感基因則是目前國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)〔3〕。脂聯(lián)素是一種脂肪因子，通過與脂聯(lián)素受體結(jié)合后有著抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化及提高胰島素敏感性等作用。本研究探討海南地區(qū)漢族人群中ACI的脂聯(lián)素APM-1基因多態(tài)性與血清脂聯(lián)素水平、血脂血壓的關(guān)系，進(jìn)一步認(rèn)識ACI的分子遺傳機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 入選標(biāo)準(zhǔn) ACI診斷以全國第四屆腦血管疾病會(huì)議修訂的腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集到ACI患者120例(男78例，女42例)，平均年齡為(58.43±10.86)歲，平均體重指數(shù)(BMI)為(26.28±2.59)kg/m2，120例正常對照者(男60例，女60例)，年齡范圍(57.96±9.52)歲，平均 BMI(23.10±2.14)kg/m2。其中 ACI組患者有高血壓史者為89人，占組內(nèi)總?cè)藬?shù)74.17%;有糖尿病史者為31人，占組內(nèi)總?cè)藬?shù)25.83%。而對照組中有高血壓史者為18人，占組內(nèi)總?cè)藬?shù)15%;有糖尿病史者為4人，占組內(nèi)總?cè)藬?shù)3.33%。健康體檢者為對照組120例，無血緣關(guān)系，同時(shí)排除有冠心病、心腦血管疾病家族史、肝腎疾病、自身免疫性疾病、血液病、妊娠、半年內(nèi)有過降脂治療者。ACI組:住院病人120例，同樣也無任何血緣關(guān)系。符合全國第四屆腦血管疾病會(huì)議修訂的腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)頭顱CT或(和)MRI確診。排除其他疾病引起的腦梗死。

1.2 DNA制備 受試者常規(guī)禁食12 h后，于次日7:00～8:00采靜脈血5 ml，采用構(gòu)椽酸鈉抗凝，利用常規(guī)酚/氯仿抽提法提取DNA。

1.3 引物設(shè)計(jì) 引物采用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，測序由上海申能博彩生物技術(shù)有限公司完成。PCR引物序列為5'-CTGAGATGGACGGAGTCCTTT-3'，5'-CCAAATCACTTCAGGTTGCTT-3'，片段長度為456 bp。

1.4 基因測序 采用PCR-RFLP結(jié)合測序技術(shù)進(jìn)行基因型分析。所有酶切產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳后應(yīng)用GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.5 血清脂聯(lián)素水平測定 采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，上海美季生物技術(shù)有限公司提供試劑盒，按說明書操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0軟件，采用HWE軟件檢驗(yàn)基因型的Hardy-Weinberg平衡吻合度，以基因計(jì)數(shù)法計(jì)算ACI組和對照組基因型和等位基因頻率。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 SNP45T/G及SNP276G/T的測序情況 見圖1，圖2。

圖1 SNP45T/G測序情況

圖2 SNP276G/T測序情況

2.2 ACI患者各血脂指標(biāo)及脂聯(lián)素水平的比較 ACI組中的總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)血清水平與對照組相比較，均有顯著的升高(P＜0.001)，ACI組中的高密度脂蛋白(HDL)及脂聯(lián)素各自的血清水平與對照組相比較，有明顯的降低，P ＜0.001。見表1。

表1 血脂及脂聯(lián)素血清學(xué)檢測比較(n=120，±s)

表1 血脂及脂聯(lián)素血清學(xué)檢測比較(n=120，±s)

組別TC(mmol/L)HDL(mmol/L)LDL(mmol/L)脂聯(lián)素(μg/ml)ACI組1.88±1.51 1.19±0.25 3.23±0.73 4.1±1.5對照組 1.40±1.29 1.34±0.41 2.80±0.52 7.0±3.3 t值 7.01 11.71 27.62 76.80 P值0.009 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 脂聯(lián)素SNP45位點(diǎn)各基因型與血清脂聯(lián)素關(guān)系分析 在ACI組的APM-1 SNP45的T/T、G/T及G/G三種基因型中，脂聯(lián)素的血清水平分別為(3.92±1.2)、(4.07±1.5)及(3.99±1.4)μg/ml(t=0.287，P=0.593)。同樣，對照組各基因型差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 脂聯(lián)素SNP45位點(diǎn)各基因型與血清脂聯(lián)素關(guān)系比較(n=120，±s)

表2 脂聯(lián)素SNP45位點(diǎn)各基因型與血清脂聯(lián)素關(guān)系比較(n=120，±s)

組別APM-1 SNP45 T/G各基因型血清脂聯(lián)素(μg/ml)T/T G/T G/G t值 P值A(chǔ)CI組3.92±1.2 4.07±1.5 3.99±1.4 0.287 0.593對照組7.12±3.3 6.88±2.7 6.96±2.8 0.150 0.700

2.4 脂聯(lián)素SNP276位點(diǎn)各基因型與血清脂聯(lián)素關(guān)系分析在ACI組的APM-1 SNP276的 T/T、G/T及G/G三種基因型中，脂聯(lián)素的血清水平分別為(4.07±1.6)、(4.01±1.4)及(3.38±0.7)μg/ml，G/G基因型與T/T基因型比較差異顯著(t=29.53，P＜0.001);而對照組各基因型的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.434)。對照組G/G基因型的血清脂聯(lián)素與其他兩種基因型比較，也有所降低，而在ACI組，G/G基因型的血清脂聯(lián)素降低較其余兩種基因型更為顯著，由此推斷，攜帶G/G基因型可能增加ACI患病的風(fēng)險(xiǎn)。見表3。

表3 脂聯(lián)素SNP276位點(diǎn)各基因型與血清脂聯(lián)素關(guān)系比較(n=120，±s)

表3 脂聯(lián)素SNP276位點(diǎn)各基因型與血清脂聯(lián)素關(guān)系比較(n=120，±s)

組別APM-1 SNP45 T/G各基因型血清脂聯(lián)素(μg/ml)T/T G/T G/G t值 P值A(chǔ)CI組4.07±1.6 4.01±1.4 3.38±0.7 29.53 ＜0.001對照組6.93±2.8 6.84±2.6 6.01±2.2 0.618 0.434

3 討論

于1995年Scherer等〔4，5〕發(fā)現(xiàn)的一種結(jié)構(gòu)類似于補(bǔ)體因子q的蛋白質(zhì)，而由脂肪細(xì)胞特異性分泌的物質(zhì)，后來命名為脂聯(lián)素。脂聯(lián)素通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥發(fā)生及白細(xì)胞的黏附，并且抑制血管平滑肌的遷移和增殖，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。脂聯(lián)素還可以降低肝臟和肌肉的甘油三酯的含量，提高脂肪酸的氧化，改善脂代謝，協(xié)助增強(qiáng)抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

脂聯(lián)素是如何抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成的機(jī)制尚未清楚。內(nèi)皮細(xì)胞損傷被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的病理改變初期。Ouchi等〔6〕用經(jīng)脂聯(lián)素處理后的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素對巨噬細(xì)胞的形成及吞噬細(xì)胞作用以及單核細(xì)胞的黏附都有一定的影響，表現(xiàn)在拮抗腫瘤壞死因子(TNF)-α的生成與發(fā)生作用。內(nèi)皮細(xì)胞被TNF-α激活后，通過NF-κB信號通路使黏附分子如VCAM-1、ICAM-1及E-selectin的mRNA表達(dá)上調(diào)，使得單核細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞表面增多，形成動(dòng)脈粥樣斑塊，這是動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵步驟。

人脂聯(lián)素基因(APM-1)進(jìn)行序列分析后發(fā)現(xiàn)，APM-1在正常人中存在一定數(shù)量的等位基因SNPs，其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列不受密碼子改變的影響。到現(xiàn)在為止發(fā)現(xiàn)了分布在APM-1上游啟動(dòng)子、內(nèi)含子與外顯子等多個(gè)區(qū)域的十多種ADP常見的 SNPs及一些罕見的錯(cuò)義突變〔7，8〕。

本文結(jié)果顯示海南漢族人群中，ACI患者血清脂聯(lián)素水平明顯低于健康人群，ACI患者APM-1 SNP276位點(diǎn)多態(tài)性與血清脂聯(lián)素水平有關(guān)，G/G基因型個(gè)體的血清脂聯(lián)素水平較低，攜帶APM-1 SNP276 G/G基因型可能增加ACI患病的風(fēng)險(xiǎn)。

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3 畢 楠.一個(gè)新的脂肪因子——脂聯(lián)素的結(jié)構(gòu)與功能的研究進(jìn)展〔J〕.中國動(dòng)脈硬化雜志，2005;13(4):520-2.

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