順鉑聯(lián)合熱療對人胃癌耐藥細(xì)胞增殖及耐藥相關(guān)基因Survivin表達(dá)的影響

董 倩 陳 虎(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院化療科，河北 石家莊 0500)

腫瘤產(chǎn)生多藥耐藥(MDR)是化療失敗的重要原因之一，尋找能夠逆轉(zhuǎn)耐藥的方法成為當(dāng)前的重要研究方向之一。目前發(fā)現(xiàn)熱療可能通過不同的作用機制，抑制腫瘤的生長，逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥，從而對化療起到協(xié)同和增效的作用〔1〕。本研究通過順鉑聯(lián)合熱療作用于人胃腺癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP，并觀察其對細(xì)胞增殖及Survivin表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃腺癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/DDP(購買于南京凱基生物有限公司)，置于RPMI1640培養(yǎng)液中，加入濃度為1 μg/ml的順鉑(山東齊魯制藥有限公司產(chǎn)品，批號是9080372DC)以維持耐藥性。兔抗人Survivin多克隆抗體(河北博海生物工程開發(fā)有限公司)。

1.2 分組 取對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)胰蛋白酶消化后，以5.0×105/瓶接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，用含順鉑0.1 μg/ml的RPMI1640培養(yǎng)基換液。熱療組、熱化療組在43℃恒溫水浴箱中加熱2 h后，與對照組、化療組同時繼續(xù)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。常規(guī)消化收集細(xì)胞，PBS液離心洗滌2遍，用70%冷乙醇(4℃)固定;調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106/ml，取 1 ml單細(xì)胞懸液，加入兔抗人Survivin抗體 0.1 ml(工作濃度1∶50)，室溫孵育 30 min，PBS液洗3次;分別加入羊抗兔 IgG二抗工作液100 μl，避光室溫孵育30 min，PBS液洗3次后上機檢測。設(shè)PBS代替一抗和二抗的陰性對照以及只加二抗的本底對照。

1.3 方法

1.3.1 FCM法檢測細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期細(xì)胞，用PBS液洗滌2次，再用鹽水洗滌2次，棄去上清，加入溴化丙啶1 ml染色，冰浴30 min，銅網(wǎng)過濾制成單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞的DNA定量分析，計算出細(xì)胞周期的時相分布和凋亡率，按公式計算增殖指數(shù)(PI)。

1.3.2 FCM法半定量檢測細(xì)胞的Survivin蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，各組均重復(fù)3瓶。常規(guī)消化收集細(xì)胞，PBS液離心洗滌2次，用70%冷乙醇(4℃)固定;調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106/ml，取1 ml單細(xì)胞懸液，加入兔抗人 Survivin抗體0.1 ml(工作濃度1∶50)，室溫孵育30 min，PBS液洗3次;分別加入羊抗兔IgG二抗工作液100 μl，避光室溫孵育30 min，PBS液洗3次后上機檢測。設(shè)PBS代替一抗和二抗的陰性對照，以及只加二抗的本底對照。以熒光指數(shù)(FI)表示蛋白表達(dá)的相對含量。均道值(平均熒光強度)=lg(測量值)×340。FI=實驗樣品均道值/對照樣品均道值。

1.3.3 RT-PCR法半定量檢測細(xì)胞的Survivin mRNA表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞，各組均重復(fù)3瓶。用Trizol提取總RNA，電泳進(jìn)行總 RNA完整性檢測。各取2 μl測其260 nm和280 nm光密度值(OD260 nm和OD280 nm)，比值在1.8～2.0之間，說明RNA純度較高，可進(jìn)行下一步檢測。將各組RNA標(biāo)本逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，PCR反應(yīng)檢測各組細(xì)胞Survivin基因的轉(zhuǎn)錄情況。以GAPDH作為內(nèi)參，片段長度為452 bp，上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCACT-3'，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。反應(yīng)條件為94℃ 5 min，94℃ 1 min，64℃ 40 s，72℃ 30 s，循環(huán)35次。設(shè)計 Survivin片段大小為447 bp，上游引物 5'-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3'，下游引物5'-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3'，反應(yīng)條件為 94℃ 2 min，94℃ 45 s，68℃ 45 s，72℃ 1 min，循環(huán)35次。上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。應(yīng)用1D Image Analysis Software進(jìn)行表達(dá)強度分析，同時以GAPDH作為內(nèi)參照。相對系數(shù)=細(xì)胞PCR產(chǎn)物表達(dá)強度/GAPDH表達(dá)強度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包，計量資料以±s表示，符合正態(tài)分布的計量資料組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組FCM檢測細(xì)胞增殖的比較 與對照組相比，化療組各細(xì)胞周期無明顯變化(P＞0.05)。熱療組、熱化療組G0/G1期的細(xì)胞比例逐漸提高，而S期的細(xì)胞比例明顯降低(P＜0.05)。與對照組及化療組相比，熱療組G2/M其細(xì)胞比例增多，但不具有顯著性(P＞0.05)。熱化療組相比各組各期細(xì)胞比例變化均具有顯著性差異(P＜0.05)。與對照組相比，化療組、熱療組PI雖然有所降低，但無顯著性差異(P＞0.05)，而熱化療組與各組相比PI明顯降低(P＜0.05)。見表1。

2.2 各組細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的比較 對照組、化療組、熱療組、熱化療組Survivin FI值分別為:1.000±0.000，1.011±0.016，0.736 ±0.008，0.629 ±0.022。與對照組相比，化療組 FI值無顯著性差異(P＞0.05)，而熱療組、熱化療組的GST-π蛋白表達(dá)的FI值逐步降低，并均具有顯著性差異(P＜0.01)。

表1 各組細(xì)胞周期及PI變化(±s，%，n=3)

表1 各組細(xì)胞周期及PI變化(±s，%，n=3)

1)與對照組比較;2)與化療組比較;3)與熱療組比較:均P＜0.05

組別 G0/G1 S G2/M PI對照組 43.81±2.11 40.30±0.80 15.89±2.56 84.11±2.56化療組 43.65±2.28 40.38±0.77 15.97±3.04 84.03±3.04熱療組 48.20±0.291)2)34.50±1.501)2) 17.30±1.79 82.70±1.79熱化療組 61.16±1.651)2)3)16.68±0.851)2)3)22.16±2.311)2)3)77.84±2.321)2)3)

2.3 各組細(xì)胞的Survivin mRNA表達(dá)的比較 對照組、化療組、熱療組、熱化療組 Survivin mRNA半定量值分別為:15.367 ±0.702，15.833 ±0.702，7.600 ±0.436，5.600 ±0.500。與對照組相比，化療組無顯著差異(P＞0.05)，而熱療組、熱化療組Survivin mRNA表達(dá)逐步降低，并均有極顯著差異(P＜0.01)。

3 討論

MDR的產(chǎn)生歸因于許多因素，包括細(xì)胞內(nèi)藥物外排及胞內(nèi)藥物重分布、啟動細(xì)胞內(nèi)解毒系統(tǒng)、拓?fù)洚悩?gòu)酶II蛋白含量及活性下降，DNA的修復(fù)損傷能力增強、細(xì)胞抗凋亡機制的參與等。

熱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是熱療殺傷腫瘤細(xì)胞的主要機制〔2，3〕。Zhang等〔4〕研究顯示奧沙利鉑對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用具有溫度依賴性，發(fā)現(xiàn)在50 μg/ml的奧沙利鉑作用下，43℃對腫瘤細(xì)胞的抑制作用最強。并且研究表明熱療可引起G0/G1期細(xì)胞周期阻滯，并通過上調(diào)P53，Bax表達(dá)和下調(diào) Bcl-2來促進(jìn)Lovo細(xì)胞凋亡。Walther等〔5〕通過體內(nèi)外41℃ ～43℃加熱處理人類結(jié)腸癌細(xì)胞HCT15和HCT16后，運用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定熱療前后TNF-α和多藥耐藥基因抑制基因(CAT)的表達(dá)，結(jié)果表明TNF-α分泌和CAT表達(dá)顯著增強，P糖蛋白(P-gp)、多藥抗藥性相關(guān)蛋白(MRP)和肺多藥抗藥性相關(guān)蛋白(LRP)表達(dá)均顯著減弱，這在一定程度上提示，熱化療可以抑制P-gp和MRP表達(dá)，逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性。

本研究發(fā)現(xiàn)熱療及順鉑聯(lián)合熱療都可以使人胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP的G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞相對增多，并且順鉑聯(lián)合熱療作用效果最明顯。這可能是熱療將細(xì)胞抑制于G1期，而G1期正是化療藥物作用的敏感點〔6〕，所以逆轉(zhuǎn)了耐藥腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性。

Survivin是細(xì)胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成員，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，在腫瘤的形成過程中起著關(guān)鍵的作用〔7〕。它廣泛表達(dá)于人的胚胎組織和各種腫瘤組織，但在正常成人分化組織中(胸腺、生殖器除外)檢測不到。Survivin mRNA在細(xì)胞周期中的G2/M期特異性高表達(dá)，其過度表達(dá)若超越細(xì)胞自身的周期調(diào)控時，就會導(dǎo)致腫瘤的形成;相反，Survivin基因缺失的細(xì)胞也不能正常進(jìn)行細(xì)胞分裂〔8，9〕。多項研究發(fā)現(xiàn)〔10，11〕，抑制Survivin的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并且能夠增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。

本研究中，單純熱療及順鉑聯(lián)合熱療作用后，SGC7901/DDP細(xì)胞中Survivin蛋白及mRNA的表達(dá)明顯的下降，并且并順鉑聯(lián)合熱療作用后下降最明顯。由此推測，熱療可能通過抑制Survivin蛋白的生成及Survivin mRNA的表達(dá)，來增強耐藥腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性。

綜上，熱療聯(lián)合順鉑化療對人胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/DDP具有明顯的抑制作用，然而腫瘤耐藥的機制是復(fù)雜的，熱療逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的機制需要進(jìn)一步研究。

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