甘油提高巴氏芽孢桿菌脲酶的熱穩(wěn)定性

許燕波 錢春香 陸兆文

(東南大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，南京211189)(東南大學(xué)江蘇省土木工程材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211189)

甘油提高巴氏芽孢桿菌脲酶的熱穩(wěn)定性

許燕波 錢春香 陸兆文

(東南大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，南京211189)
(東南大學(xué)江蘇省土木工程材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211189)

摘 要:研究了保存時間和保存溫度對碳酸鹽礦化菌脲酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)在低溫4℃條件下，脲酶活性在29 d內(nèi)出現(xiàn)不同程度下降;常溫短期儲存時，酶活性可以保持3 d，3 d后酶活性值下降明顯.為提高脲酶的熱穩(wěn)定性，向碳酸鹽礦化菌中添加甘油作為保護(hù)劑，常溫下添加總體積分?jǐn)?shù)20%的甘油，可以提高酶的穩(wěn)定性，脲酶活性在30℃下3 d內(nèi)保持不變，但甘油保護(hù)作用有限，高溫儲存超過7 d后酶活性值下降明顯;而在保存溫度4℃條件下，添加體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油，碳酸鹽礦化菌可以儲存30 d，底物分解量可以達(dá)到初始菌液的95%.

關(guān)鍵詞:碳酸鹽礦化菌;脲酶;甘油;熱穩(wěn)定性

巴氏芽孢桿菌是一株碳酸鹽礦化菌株，在生長過程中產(chǎn)生的脲酶具有分解尿素、產(chǎn)生碳酸根的能力.利用碳酸鹽礦化菌的這種特性，學(xué)者們開展了碳酸鹽礦化菌在文物修復(fù)、土壤固化、治沙固沙、重金屬污染處理等領(lǐng)域的應(yīng)用研究，并取得積極的成果［1－5］.

脲酶，系統(tǒng)命名為酰胺水解酶(urea amidohydrolase)，是人類首次獲得晶體并發(fā)現(xiàn)含有鎳離子的金屬酶.酶作為一種具有催化活性的蛋白質(zhì)，易受到多種因素影響而喪失活性，一般酶要避免處于高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的環(huán)境中，例如，高溫會導(dǎo)致氫鍵或者疏水鍵破壞［6－7］.因此，實(shí)現(xiàn)碳酸鹽礦化菌在上述領(lǐng)域的規(guī)模應(yīng)用，必須考慮脲酶的穩(wěn)定性問題.

添加保護(hù)劑是目前工業(yè)上提高酶穩(wěn)定性的最重要手段［6］.劉朝輝等［7］研究了幾種糖類和多元醇類保護(hù)劑提高β-甘露聚糖酶熱穩(wěn)定性的作用，研究表明，蔗糖、殼聚糖和山梨醇濃度均為2 g/L時能夠顯著提高該酶的熱穩(wěn)定性.鄭賢良等［8］通過向重組α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(α-CGT酶)液中添加化學(xué)添加劑來提高其熱穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性，研究了在不同溫度下添加劑對酶液貯存穩(wěn)定性的影響，當(dāng)單獨(dú)加入各種添加劑在50℃水浴1 h和室溫放置108 d后，發(fā)現(xiàn)含有20%甘油的酶液穩(wěn)定性最好.

本文研究保存時間和保存溫度對碳酸鹽礦化菌脲酶活性的影響，并添加甘油作為保護(hù)劑，從而提高脲酶的熱穩(wěn)定性，為礦化菌的應(yīng)用提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

試劑藥品為乙二醇、甘油、對二甲氨基苯甲醛、濃鹽酸和乙醇，均為分析純.碳酸鹽礦化菌由本實(shí)驗(yàn)室自己培養(yǎng)制備.

實(shí)驗(yàn)儀器有756紫外可見分光光度計(jì)、DDS－12A計(jì)電導(dǎo)率測定儀、冷凍恒溫振蕩器(HZ－9210K)、單人單面凈化工作臺(SW-CJ-1FD)和隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9160BS－Ⅲ).

1.2 酶活性測定方法

脲酶的活性以其單位時間內(nèi)分解尿素的能力來表征.脲酶的活性測試方法有很多，本文選擇電導(dǎo)率法和比色法來測量菌液中的脲酶活性U.

1)電導(dǎo)率法測定脲酶活性

溶液的電導(dǎo)率與溶液中離子的濃度密切相關(guān).隨著微生物分解底物、溶液中銨根離子和碳酸根離子濃度增高，溶液的電導(dǎo)率也隨之增高.

配制2 mol/L的尿素溶液，取25 mL于燒杯中，并加入20 mL去離子水，放入恒溫水浴鍋中，攪拌速度設(shè)置為250 r/min.取5 mL完全生長好的菌液，并立即注射到燒杯中，每隔30 s記錄電導(dǎo)率的數(shù)值，直到電導(dǎo)率的數(shù)值變化趨穩(wěn)，電導(dǎo)率的變化值記為k.單位酶活性值記為U，U=2×10kAμmol·urea/min，其中，A為特定系數(shù)，取11.11.

2)比色法

菌株的酶活性是通過測定直接底物的殘留量來確定的.底物濃度的測定方法是利用顯色劑(對二甲氨基苯甲醛)在酸性條件下與底物反應(yīng)，生成的對二甲氨基甲醛脲為檸檬黃色化合物，其顏色的深淺與底物含量成正比，可以用比色法測定.樣品中的氨和二氧化碳主要改變顯色液的酸度，可以通過加酸中和的方法消除干擾.其反應(yīng)式為

稱取4 g對二甲氨基苯甲醛，溶于200 mL無水乙醇中，加入20 mL濃鹽酸，混合均勻，儲存于棕色試劑瓶中.

配制標(biāo)準(zhǔn)尿素濃度的溶液，分別移取1，2，4，5 mL尿素溶液于50 mL容量瓶中，加入5 mL對二甲氨基苯甲醛溶液，混合定容.在比色皿中依次得到430 nm波長下的光密度值(OD)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線［9］，如圖 1 所示.

圖1 尿素濃度－吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3 脲酶活性變化

溫度和時間是對微生物生命活動影響較重要的影響因素.而在實(shí)際使用過程中又必須考慮短期保存和長期保存2種情況.選擇冰箱的常用冷藏溫度4℃作為長期保存溫度，在短期保存情況下，選擇15，20，25，30和40℃作為短期儲存溫度和酶活性測試溫度，分析脲酶活性隨時間變化.

1.4 保護(hù)劑提高脲酶穩(wěn)定性

對加入保護(hù)劑的脲酶，在不同溫度下保存后，向每100 mL菌液中加入過量的尿素，通過測定對底物的分解能力，分析脲酶活性在不同溫度下的穩(wěn)定性變化.

2 結(jié)果與討論

2.1 保存條件對菌株脲酶活性的影響

4 ℃是常用的冷凍保藏溫度，將100 mL培養(yǎng)好的菌液(去離子水調(diào)整OD值為1.2)儲存于4℃冰箱中，利用電導(dǎo)率法測定脲酶活性變化，并選擇15，20，25，30和40℃作為測試溫度點(diǎn)，結(jié)果如表1所示.實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在4℃保存條件下，5 d內(nèi)電導(dǎo)率顯示的脲酶活性在各個測試溫度點(diǎn)保持不變.而40℃測試溫度點(diǎn)的酶活性值在29 d后從6.66 μmol·urea/min 降到 4.44 μmol·urea/min，下降了33%.15℃測試溫度點(diǎn)的酶活性值15 d內(nèi)基本不變，在15 d后則由于電導(dǎo)率變化值太小而無法測出，這是因?yàn)槊富钚灾档拇笮∫资軠囟扔绊懀跍y試溫度較高時酶分解底物的反應(yīng)速度較快，從而導(dǎo)致顯示的電導(dǎo)率的變化值較大，測試溫度較低時則變化值較小.在20，25，30和40℃測試溫度點(diǎn)，22 d后酶活性值下降均較為明顯.

選擇15，20，25，30和40℃作為常溫下的保存溫度和測試溫度點(diǎn)，分析脲酶活性變化，結(jié)果如表1所示.

表1 不同測試溫度的脲酶活性(OD=1.2) μmol·urea/min

當(dāng)測試溫度為15℃，保存溫度為15，20和25℃時，酶活性值在3 d內(nèi)可以測出，而在保存溫度為30和40℃條件下，3 d后已經(jīng)無法測出.當(dāng)測試溫度為25℃時，在保存溫度為15，20和25℃條件下，酶活性值在3 d后下降50%，5 d后從4.44 μmol·urea/min 降到 1 μmol·urea/min 左右，而在30和40℃保存條件下，3 d后下降幅度超過了50%，5 d后酶活性值下降到低于1 μmol·urea/min.因此，常溫下脲酶活性可以保持3 d，在3 d后下降明顯.

2.2 保護(hù)劑對脲酶活性影響

碳酸鹽礦化菌不可避免會受到保存溫度和時間的影響，活性降低.乙二醇和甘油作為多元醇，是常見的保護(hù)劑.實(shí)驗(yàn)中向每100 mL菌液(OD=1.2)中添加保護(hù)劑.保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)和種類分別為0%、20%乙二醇、30%乙二醇、10%乙二醇 +10%甘油、20%甘油和30%甘油.在30℃下保存3 d后，加入過量的尿素，分析菌液對尿素的分解量.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.

圖2 保護(hù)劑對底物分解量的影響

乙二醇的保護(hù)作用并不理想，初始100 mL菌液的底物分解量為8.4 g，30℃保存3 d后分解量減少為5.28 g，添加20%乙二醇后100 mL菌液對底物的分解量為5 g.并且乙二醇體積分?jǐn)?shù)增加并不能提高保護(hù)性能，添加30%的乙二醇后底物分解量為2.2 g，但甘油的體積分?jǐn)?shù)只占10%，底物分解量明顯提高.含有20%甘油作為保護(hù)劑的菌液3 d后分解量與初始無異，證明甘油是一種可以用于碳酸鹽礦化菌的良好保護(hù)劑.

添加甘油作為保護(hù)劑能保持較穩(wěn)定的酶活性，這是因?yàn)楦视团c水分子相互作用，改變了水的表面張力，使酶與水之間形成溶劑層，同時甘油的羥基與酶的酰胺基以氫鍵的方式相互作用，促進(jìn)酶的熱穩(wěn)定性.甘油分子較小，可以結(jié)合在酶分子的肽鏈空隙里，增強(qiáng)了分子內(nèi)的疏水作用，減少酶分子間的相互作用;另一方面可阻止部分導(dǎo)致酶失活的物質(zhì)接近活性中心，從而提高了酶的穩(wěn)定性.

向每100 mL碳酸鹽礦化菌(OD=1.2)中添加甘油作為保護(hù)劑，甘油保護(hù)劑的體積分?jǐn)?shù)分別為0%，5%，10%，15%和20%，同時選擇15，30和40℃三個溫度點(diǎn)作為短期保存溫度，菌液在各保存溫度下放置7 d后，取出并向其中加入過量底物，用比色法分析底物的分解量.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示.

圖3 甘油保護(hù)不同溫度下放置7 d底物分解圖

在保存溫度15℃儲存7 d后，空白試樣底物分解量為2.90 g，達(dá)到初始菌液底物分解量的35%;而添加了甘油作為保護(hù)劑的試樣，底物分解量與空白試樣相比都得到提高，且隨著體積分?jǐn)?shù)增加而增加，甘油保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)為20%時，達(dá)到初始菌液底物分解量的73%.

在保存溫度30℃儲存7 d后，空白試樣底物分解量為初始分解量的15%;而添加了甘油作為保護(hù)劑的試樣，底物分解量都在50%以上，且隨著甘油保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)的增加，底物分解量也相應(yīng)增加，但增加幅度不如15℃條件下的增幅明顯.

在保存溫度40℃放置7 d，空白試樣的底物分解量為1.53 g;而添加了甘油作為保護(hù)劑的試樣，底物分解量也均未超過50%，甘油保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)為20%，底物分解量也只有3.60 g，說明在儲存溫度較高的情況下甘油保護(hù)作用是有限的.

同樣，4℃作為長期保存溫度，向每100 mL菌液中添加甘油作為保護(hù)劑，保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)依次為0%，5%，10%，15%和20%.菌液儲存30 d后，取出并向其中加入過量的底物尿素，用比色法分析底物分解量.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示.

圖4 甘油保護(hù)下于4℃儲存30 d底物分解圖

在保存溫度4℃條件下保存30 d后，未添加甘油保護(hù)劑的空白試樣，底物最大分解量為6.88 g，達(dá)到了初始菌液底物分解量的82.5%.添加了甘油作為保護(hù)劑的試樣，結(jié)果差距不大，甘油保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)10%的試樣，底物最大分解量為7.94 g，達(dá)到初始菌液底物分解量的95%.這一方面是由于甘油的保護(hù)作用，另一方面微生物在4℃條件下進(jìn)入休眠狀態(tài)，生命活動停止，酶活性保持穩(wěn)定，溫度提高后加入底物后酶重新開始分解底物.

考慮到實(shí)際使用時的需要，常溫下(10～40℃)保存時，選擇體積分?jǐn)?shù)為20%的甘油作為碳酸鹽礦化菌的保護(hù)劑，即向每1 L菌液中添加250 mL甘油，同時保存時間不宜超過7 d.碳酸鹽礦化菌的長期保存可以選擇4℃，甘油保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)為10%.

3 結(jié)論

1)碳酸鹽礦化菌的脲酶活性在4℃條件下保存，5 d內(nèi)電導(dǎo)率顯示的脲酶活性在各個測試溫度點(diǎn)保持不變;在15℃測試溫度點(diǎn)，15 d后酶活性值由于電導(dǎo)率變化太小而無法測出，在20，25，30和40℃測試溫度點(diǎn)，酶活性值22 d后下降均明顯;常溫短期儲存時，酶活性可以保持3 d，在3 d后酶活性值明顯下降.

2)為保持酶活性的穩(wěn)定性，向碳酸鹽礦化菌中添加甘油作為保護(hù)劑.研究發(fā)現(xiàn)，常溫下添加總體積分?jǐn)?shù)20%的甘油，可以提高酶的穩(wěn)定性，但甘油保護(hù)作用有限，高溫儲存超過7 d后酶活性值明顯下降;而保存溫度4℃條件下，體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油作為保護(hù)劑，碳酸鹽礦化菌可以長期儲存30 d，底物分解量可達(dá)到初始菌液的95%.

［1］李沛豪，居文俊.細(xì)菌誘導(dǎo)碳酸鈣礦化材料及其應(yīng)用前景［J］.建筑材料學(xué)報(bào)，2009，12(4):482－486.

Li Peihao，Ju Wenjun.Applications of calcium carbonate mineralization material induced by bacterium［J］.Journal of Building Materials，2009，12(4):482 － 486.(in Chinese)

［2］黃琰，羅學(xué)剛，何晶，等.微生物在石英砂中誘導(dǎo)方解石沉積的實(shí)驗(yàn)研究［J］.西南科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，24(2):65－69.

Huang Yan，Luo Xuegang，He Jing，et al.Studies on the experiment of microbiologically-induced calcite precipitation in silica［J］.Journal of Southwest University of Science and Technology，2009，24(2):65 －69.(in Chinese)

［3］黃琰，羅學(xué)剛，杜菲.微生物誘導(dǎo)方解石沉積加固的影響因素［J］.西南科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，24(3):87－93.

Huang Yan，Luo Xuegang，Du Fei.Studies on the effect factor of microbiologically-induced calcite precipitation［J］.Journal of Southwest University of Science and Tech-nology，2009，24(3):87－93.(in Chinese)

［4］成亮，錢春香，王瑞興，等.碳酸鹽礦化菌株固結(jié)土壤Cd2+的生物礦化過程［J］.硅酸鹽學(xué)報(bào)，2008，36(增刊1):216－222.

Cheng Liang，Qian Chunxiang，Wang Ruixing，et al.Bioremedidation process of Cd2+removal from soil by bacteria biomineralization［J］.Chinese Ceramic Society，2008，36(S1):216 －222.(in Chinese)

［5］Sondi I，Matijevic E.Homogeneous precipitation by enzyme-catalyzed reactions-strontium and barium carbonates［J］.Chemistry of Materials，2003，15(6):1322 －1326.

［6］李麗.微生物酶促形成方解石膠結(jié)砂粒的實(shí)驗(yàn)與模擬［D］.南京:東南大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，2011.

［7］劉朝輝，武偉娜，劉躍，等.保護(hù)劑提高β-甘露聚糖酶熱穩(wěn)定性的研究［J］.天津大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，41(1):114－118.

Liu Zhaohui，Wu Weina，Liu Yue，et al.Enhancing the thermostability of β-mannanase by protective additives［J］.Journal of Tianjin University，2008，41(1):114 －118.(in Chinese)

［8］鄭賢良，吳丹，李兆豐，等.化學(xué)添加劑提高重組α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶制劑穩(wěn)定性［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2011，27(2):185 －195.

Zheng Xianliang，Wu Dan，Li Zhaofeng，et al.Enhanced storage stability of recombinant enzyme preparation of α-CGTase from Paenibacillus macerans by chemical additives［J］.Chinese Journal of Biotechnology，2011，27(2):185 －195.(in Chinese)

［9］李亞星，徐秋明，曹一平，等.分光光度法測定樹脂包衣尿素溶出的研究［J］.中國土壤與肥料，2010(1):84－87.

Li Yaxing，Xu Qiuming，Cao Yiping，et al.Colorimetric estimation of urea release rate in coated urea［J］.Soil and Fertilizer Science in China，2010(1):84 －87.(in Chinese)

Study on enhancing urease thermostability of Bacillus pasteurii by glycerol

Xu Yanbo Qian Chunxiang Lu Zhaowen
(School of Materials Science and Engineering Southeast University，Nanjing 211189，China)(Jiangsu Key Laboratory of Construction Materials，Southeast University，Nanjing 211189，China)

Abstract:Effect of preservation time and temperature on the carbonate-mineralization microbe urease activity is studied.The urease activity decreases in 29 days at 4℃ while it can be kept for 3 days at normal temperature before obvious decrease afterwards.Glycerol is selected as the protective additive to enhance the urease thermostability.The urease activity keep stable for 3 days at 30℃，and the best volume fraction for glycerol is 20%at normal temperature.However its effect of preservation is limited，and the urease activity decreases obviously after 7 days at high store temperature.The decomposition ability can reach up to 95%at 4 ℃ after 30 days with 10%glycerol，and the carbonate-mineralization microbe can be kept in reserve for a month.

Key words:carbonate-mineralization microbe;urease;glycerol;thermostability

中圖分類號:Q89

A

1001－0505(2013)01-0147-05

doi:10.3969/j.issn.1001 －0505.2013.01.028

收稿日期:2012-04-16.

許燕波(1986—)，男，碩士生;錢春香(聯(lián)系人)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，cxqian@seu.edu.cn.

基金項(xiàng)目:江蘇省科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(BK2010062).

引文格式:許燕波，錢春香，陸兆文.甘油提高巴氏芽孢桿菌脲酶的熱穩(wěn)定性［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2013，43(1):147－151.［doi:10.3969/j.issn.1001 －0505.2013.01.028］