中藥枳殼葡萄內(nèi)酯活性代謝產(chǎn)物的色譜篩選※

● 黃 群 楊 改紅 袁 金斌 楊武亮 陳 海芳 楊 明

老年癡呆嚴(yán)重影響老年人的健康和生活質(zhì)量，同時給家庭和社會帶來巨大經(jīng)濟(jì)壓力和負(fù)擔(dān)。乙酰膽堿酯酶抑制劑(acetylcholinesterase inhibitor，AchEI)是防治該病的主流藥物，尋找新的AchEI一直是該類藥物研發(fā)的熱點(diǎn)［1］。近年來，本實(shí)驗(yàn)室已從中藥枳殼中篩選得到一種溫和的AchEI，即葡萄內(nèi)酯。葡萄內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)［2－4］和代謝特性實(shí)驗(yàn)表明:葡萄內(nèi)酯口服給藥后，迅速被代謝轉(zhuǎn)化，血漿中檢測不到原形藥物，幾個代謝產(chǎn)物隨給藥時間呈規(guī)律變化，起藥效作用的可能是其代謝產(chǎn)物。

藥物代謝研究是藥物早期篩選的重要研究內(nèi)容。但是由于藥物的代謝產(chǎn)物樣品量少、基質(zhì)復(fù)雜，使得活性代謝產(chǎn)物的篩選幾乎不可能按照傳統(tǒng)的“分離→純化→篩選”模式進(jìn)行［5］。高效液相色譜(HPLC)具有分離效率高、靈敏度好、檢測手段多等優(yōu)點(diǎn)，是目前分離分析中最常用的方法，將其與活性篩選相結(jié)合可以對活性物質(zhì)進(jìn)行有目的的跟蹤，使活性物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)和分離的時間大大縮短［6］。

近年來，各種色譜聯(lián)用技術(shù)在天然產(chǎn)物包括中藥活性物質(zhì)篩選中的應(yīng)用越來越多［6－10］。本文擬開發(fā)一種色譜與生物活性檢測、紫外檢測和質(zhì)譜檢測的多維聯(lián)用技術(shù)，篩選鑒定葡萄內(nèi)酯的活性代謝產(chǎn)物，為其進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與實(shí)驗(yàn)動物 葡萄內(nèi)酯為從枳殼中分離純化得到，采用高效液相色譜法檢查其含量不低于98%;乙酰膽堿酯酶(BR，220U/mg)、聯(lián)硫代雙硝基苯甲酸(DTNB)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;牛血清蛋白(BSA)購自杭州四季青試劑公司;其它試劑均為分析純。SD大鼠，♂，體重200～220g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件:塑料盒飼養(yǎng);自由攝水，光照12小時明暗交替。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent 6410液相色譜－三級四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent科技，USA)、Agilent 1200液相色譜儀、Waters 510色譜泵、0.5mm內(nèi)徑300μl體積的PFA環(huán)管(反應(yīng)器)、高速冷凍離心機(jī)(SIGMA－18，SIGMA 公司，德國)、普通離心機(jī)(XiangYi L500，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)。

1.3 方法原理 如圖1所示，在輔助泵的驅(qū)動下，AchE和與巰基顯色劑DTNB按比例混合，繼而與ASch(硫代乙酰膽堿)混合，然后在反應(yīng)環(huán)管中發(fā)生特異性反應(yīng)，AchE水解ASch生成硫代膽堿和乙酸。硫代膽堿與DTNB反應(yīng)形成黃色化合物TNB，其于412nm處有特征吸收。進(jìn)樣后，如果樣品中含有AchE抑制劑，則其先與AchE反應(yīng)，而與ASch反應(yīng)的AchE減少，生成的TNB減少，檢測器信號降低，在色譜圖上表現(xiàn)為負(fù)峰。在生物活性檢測與HPLC在線聯(lián)用的基礎(chǔ)上，同步進(jìn)行HPLC與二極管陣列檢測(DAD)及質(zhì)譜(MS)的聯(lián)用分析，就能同時實(shí)現(xiàn)活性化合物的在線篩選和迅速的結(jié)構(gòu)鑒定。

圖1 儀器配置及分析流程圖

1.4 溶液制備 實(shí)驗(yàn)全程使用50mM的Tris－HCl緩沖溶液。以緩沖溶液溶解AchE得到1000U/mL的儲備溶液，儲存于低溫冰箱。用0.1%BSA(溶于緩沖溶液)逐次稀釋儲備液，得到AchE工作溶液。含0.1M NaCl和0.02M MgCl2的緩沖溶液用于制備DTNB溶液。直接用重蒸水制備ASch溶液。

1.5 樣品制備 葡萄內(nèi)酯以0.4%CMC－Na溶液渾懸，灌胃給藥，劑量為 30mg/kg，于 0，30，60和90min自眼眶后靜脈叢取血。血樣經(jīng)肝素抗凝，4000r/min離心10min分離血漿。取血漿200μL，加1mL乙酸乙酯，渦旋混勻，靜置分層，4000r/min離心5min分離乙酸乙酯層，重復(fù)1次，合并萃取液;乙酸乙酯層置氮?dú)庀麓蹈桑?00μL甲醇溶解殘?jiān)?甲醇溶液于15000r/min離心10min，上清液用于色譜分析。

1.6 AchE抑制劑的色譜篩選 色譜條件:Dikma Diamonsil C18(4.6 ×250mm，5μm)色譜柱;乙腈―0.1%甲酸梯度洗脫(梯度條件見表1);流速:1.0mL/min，分流至質(zhì)譜0.4ml/min，分流至生化反應(yīng)與檢測系統(tǒng)40μL/min;322nm為葡萄內(nèi)酯及其代謝產(chǎn)物的檢測波長。串聯(lián)質(zhì)譜條件:電噴霧離子化(ESI);毛細(xì)管電壓4.5kv;脫溶劑氣溫度:350℃;氣體流量:10L/min;噴嘴壓力:40psi。生化反應(yīng)與檢測系統(tǒng):用低死體積的PEEK毛細(xì)管(內(nèi)徑64μm)連接整個反應(yīng)體系;反應(yīng)物的濃度分別為0.1mM DTNB、0.1U/mL AchE和0.1mM ASch;所有反應(yīng)物的流速均為40μL/min;反應(yīng)環(huán)管置于50℃的水浴中。檢測波長為412nm。

表1 流動相的梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 生化反應(yīng)條件的優(yōu)化 硫代乙酰膽堿(ASch)－聯(lián)硫代雙硝基苯甲酸(DTNB)分光光度法是AchE的標(biāo)準(zhǔn)分析方法，反應(yīng)溫度一般為37℃。為加快反應(yīng)速度，本文采用50℃作為反應(yīng)環(huán)管的溫度。如圖1所示，相對于代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜和UV(322nm)檢測，生化檢測由于反應(yīng)環(huán)管及整個管路的延長，化合物的保留時間延遲了近4min。我們以葡萄內(nèi)酯為模型藥物，以UV信號為指標(biāo)對各反應(yīng)物的濃度、流速進(jìn)行了系統(tǒng)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)DTNB為0.1mM，AchE為0.1U/mL，ASch為0.1mM，且流速為40μL/min，系統(tǒng)的背景噪音較小，信噪比較大。

圖2 血漿樣品的典型HPLC－DAD－ESI－MS/MS色譜圖

2.2 葡萄內(nèi)酯主要代謝產(chǎn)物的分析 課題組在大鼠藥代動力學(xué)研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)血漿中有疑似代謝產(chǎn)物隨給藥時間的變化而變化。為此著手建立了葡萄內(nèi)酯原型藥及其可能的代謝產(chǎn)物的色譜聯(lián)用分析技術(shù)，相關(guān)的色譜圖見圖2，圖中兩個代謝產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)已確認(rèn)(相關(guān)工作另文報道)。由于多數(shù)藥物的代謝物保留了原藥分子的骨架結(jié)構(gòu)或一些亞結(jié)構(gòu)，因此，代謝物可能進(jìn)行與原藥相似的裂解，丟失一些相同的中性碎片或形成一些相同的特征離子。用串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行中性丟失掃描、母離子掃描以及子離子掃描，即可迅速找到可能的代謝物，并鑒定出結(jié)構(gòu)。

2.3 活性代謝產(chǎn)物的篩選 葡萄內(nèi)酯活性代謝產(chǎn)物的篩選結(jié)果見圖3，色譜圖中的負(fù)峰代表可能的活性代謝產(chǎn)物。經(jīng)過系統(tǒng)比對，發(fā)現(xiàn)保留時間(tR)為14和16分鐘的兩個負(fù)峰與圖2中檢出的兩個代謝產(chǎn)物呈對應(yīng)關(guān)系(保留時間延遲4min)。從圖2可以看出，前一個色譜峰大于后一個色譜峰，而圖3的結(jié)果正好相反，后一個代謝產(chǎn)物的乙酰膽堿酯酶抑制活性更強(qiáng)。

3 結(jié)論

本文所提出來的色譜聯(lián)用技術(shù)已成功地應(yīng)用于葡萄內(nèi)酯活性代謝產(chǎn)物的在線篩選，為葡萄內(nèi)酯的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)。如能繼續(xù)改進(jìn)靈敏度，該法可以應(yīng)用于生物體系中乙酰膽堿酯酶抑制劑的分離、篩選和鑒定。

圖3 葡萄內(nèi)酯代謝產(chǎn)物(1h的血樣)生化檢測的典型色譜圖

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